华南地区猪场流感病毒血清学调查及重组H3N2亚型SIV候选疫苗株的初步研究

发布时间：2017-09-18 11:22

  本文关键词：华南地区猪场流感病毒血清学调查及重组H3N2亚型SIV候选疫苗株的初步研究

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【摘要】：猪是流感病毒重要的宿主之一,不仅能感染人流感病毒,而且能感染禽流感病毒,对当前的流感生态环境的形成起到重要的作用。甲型H1N1/2009流感病毒的爆发,说明猪能够独立地促进流感毒株的产生。猪流感(Swine Influenza,SI)由猪流感病毒(Swine Influenza Virus,SIV)引起,是一种急性和高度感染性呼吸系统性疾病,一般呈现地方流行性。典型的临床症状表现为突发性咳嗽、高热、嗜睡、厌食、鼻涕、呼吸困难和体重下降等,具有高发病率但低死亡率的特征。SI极易导致继发感染或混合感染,以致进一步发展成猪呼吸道疾病综合症,造成一定的经济损失。H1N1、H1N2和H3N2亚型猪流感病毒是目前主要的流行毒株。为了调查中国华南地区猪群猪流感病毒和甲型H1N1/2009流感病毒(H1N1pdm09)的流行情况,本研究于2013年10月至2014年9月期间,在中国华南地区的广东省、江西省、湖南省、福建省和广西壮族自治区共73个猪场,采集未进行流感疫苗免疫的临床健康猪的血清样品2,208份。采用欧亚类禽猪流感H1N1、类人猪流感H3N2和甲型H1N1pdm09流感病毒,通过血凝抑制试验(HI),对这2,208份血清进行SIV和H1N1pdm09流感病毒血清学检测。结果显示流感病毒抗体为阳性的血清共1,269份(57.42%)。SIV和H1N1pdm09流感病毒的流行存在明显的区域性差异,其中广东省和广西壮族自治区的感染率最高(p0.01),分别为64.48%和75.00%。EA H1N1、H3N2 SIV和H1N1pdm09流感病毒抗体阳性率分别是22.51%、32.97%和26.49%。H1N1pdm09流感病毒的抗体几何平均滴度(Geometric Mean Antibody Titers,GMT)最高(91.93±1.04,p0.05)。EA H1N1和H3N2 SIV在冬季血清阳性率最高,然而在冬末(2月)阳性率却最低(p0.01)。H1N1pdm09流感病毒抗体阳性率在5月和9月出现高峰(p0.01)。母猪体内的EA H1N1和H1N1pdm09流感病毒抗体阳性率分别为25.93%和28.04%,均比仔猪(19.63%和23.29%)和育肥猪(22.32%和27.16%)高,但仔猪的H3N2 SIV抗体阳性率却比较高。本研究为华南地区猪场SIV和H1N1pdm09流感病毒的预防提供参考依据。普遍认为,疫苗是抵抗流感病毒感染最有效的方法。至今,油佐剂的全病毒灭活疫苗是应用最广泛且技术最成熟的猪流感病毒疫苗。本研究利用反向遗传技术,成功构建了H3N2亚型猪流感病毒L22的8质粒系统。将A/swine/Guangdong/L22/2010(H3N2)猪流感病毒的HA、NA基因与A/Puerto Rico/8/1934的6个内部基因片段重组,拯救出rL22/PR8。经鉴定,rL22/PR8的基因序列与亲本毒株和PR8的相应基因片段序列一致。将rL22/PR8接种至9日龄的SPF鸡胚后,其HA血凝效价提高到210,EID50结果提高到1.78×109EID50/mL,且未见鸡胚死亡,说明重组病毒rL22/PR8具有良好的鸡胚适应性。将rL22/PR8全病毒灭活疫苗辅以佐剂免疫小鼠,通过检测血清中的HI抗体评价其免疫效果,结果表明该疫苗能有效刺激小鼠产生高滴度的HI抗体,可达1920。研究为疫苗的研发奠定了基础,rL22/PR8可以作为疫苗候选株。
【关键词】：猪流感 血清学调查 灭活疫苗 反向遗传学技术 免疫原性
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 缩略词表7-11
• 1 前言11-23
• 1.1 猪流感概述11-19
• 1.1.1 猪流感的感染特征11-12
• 1.1.2 猪流感病原学12-16
• 1.1.3 猪流感病毒的复制16-17
• 1.1.4 猪流感的流行病学17-19
• 1.2 猪流感疫苗19-21
• 1.2.1 灭活疫苗19
• 1.2.2 重组蛋白疫苗19-20
• 1.2.3 载体疫苗20
• 1.2.4 DNA疫苗20-21
• 1.3 反向遗传技术21-22
• 1.4 本实验研究的目的和意义22-23
• 2 材料与方法23-42
• 2.1 材料23-28
• 2.1.1 毒株23
• 2.1.2 血清样品收集23-24
• 2.1.3 仪器及试剂24-26
• 2.1.4 菌种26
• 2.1.5 鸡胚26
• 2.1.6 细胞系26
• 2.1.7 实验动物26-27
• 2.1.8 鸡红细胞27
• 2.1.9 质粒和载体27
• 2.1.10 引物27-28
• 2.2 试验方法28-42
• 2.2.1 猪流感病毒和甲型流感病毒的血清学调查的方法28-34
• 2.2.2 重组H3N2流感病毒疫苗株的构建与鉴定34-41
• 2.2.3 重组H3N2灭活疫苗的免疫效果评价的方法41-42
• 3 结果与分析42-53
• 3.1 血清学调查结果42-48
• 3.1.1 猪流感病毒HA基因扩增结果42
• 3.1.2 猪流感病毒HA基因序列分析结果42-44
• 3.1.3 血清抗体检测结果44-45
• 3.1.4 血清抗体滴度分布情况以及其GMT45-46
• 3.1.5 流感病毒的季节性流行特征46
• 3.1.6 华南地区不同省份猪场流感病毒的感染情况46-47
• 3.1.7 不同生长阶段猪群流感病毒的感染情况47-48
• 3.2 重组疫苗株的构建与鉴定结果48-52
• 3.2.1 H3N2猪流感病毒L22的RT-PCR扩增结果48
• 3.2.2 重组p HW2000阳性质粒鉴定结果48-49
• 3.2.3 拯救病毒的鉴定结果49-50
• 3.2.4 病毒HA血凝效价的测定结果50-51
• 3.2.5 病毒EID50的测定结果51
• 3.2.6 病毒TCID50的测定结果51
• 3.2.7 病毒的鸡胚生长曲线结果51-52
• 3.3 灭活疫苗的免疫效果评价52-53
• 4 讨论53-59
• 4.1 血清学调查结果讨论53-55
• 4.2 制备重组H3N2灭活疫苗的结果讨论55-57
• 4.3 疫苗免疫效果讨论57-58
• 4.4 全文总结58-59
• 致谢59-60
• 参考文献60-69
• 附录69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 何淑仪;马骏;方博;孙彦阔;罗永峰;秦锋;郑运;曹振鹏;周沛;粟硕;张桂红;;华南地区猪场猪流感和甲型H1N1/2009流感病毒的血清学调查[J];中国预防兽医学报;2015年09期

2 王艳平;;影响疫苗免疫效果的因素及措施[J];中国动物保健;2015年08期

3 李颖婷;谢剑锋;郑奎城;;流感病毒反向遗传技术的研究进展[J];海峡预防医学杂志;2015年03期

4 周洋;耿兴超;汪巨峰;李波;;疫苗佐剂最新研究进展[J];中国新药杂志;2013年01期

5 赵朴;郑玉姝;刘俊伟;李任峰;姚四新;刘兴友;;猪流感继发多杀性巴氏杆菌感染的诊断[J];广东农业科学;2010年02期

6 谢金文;苗立中;沈志强;;猪流感病毒蛋白研究进展[J];中国畜牧兽医;2009年11期

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本文编号：875214