鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌耐药性的传递研究

发布时间：2017-09-18 13:11

  本文关键词：鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌耐药性的传递研究

  更多相关文章： 鸭疫里默氏菌 大肠杆菌 混合传代培养 耐药性传递

【摘要】：鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)病和大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)病是危害家禽养殖业最为严重的两大细菌性传染病,两种细菌感染均可引起鸭败血症、纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎等。这两种病原在临床上常出现混合感染现象,混合感染容易发生耐药性的水平传递,使得二者的耐药谱扩大,导致药物治疗失败,给家禽养殖业造成严重的经济损失。作为细菌混合感染的耐药性传递已有不少研究,但是鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌两个不同种属间耐药性的传递研究还没有报道。本文筛选出耐药性的RA和敏感性的E.coli进行体外混合传代培养,并对混合传代培养后筛选到的耐药性大肠杆菌进行了耐药性分析。本实验从山东地区疑似发病鸭进行病料收集、细菌分离鉴定共获得鸭疫里默氏杆菌4株,采用k-B纸片法进行了4株RA分离株及2株E.coli标准株对24种常用抗生素的药物敏感试验。药敏结果显示,4株RA对氨基糖苷类(庆大霉素、妥布霉素和卡那霉素)及喹诺酮类(环丙沙星、氧氟沙星和诺氟沙星)均为耐药,2株大肠杆菌对这6种抗生素均为敏感,根据具体数据,选择RA P3菌株和E.coli标准株8099分别作为耐药性转移实验的供体菌和受体菌,用于混合传代培养。并采用试管双倍稀释法进行了RA P3菌株和E.coli标准株CMCC 8099对庆大霉素、妥布霉素、卡那霉素、环丙沙星、氧氟沙星和诺氟沙星最低抑菌浓度(MIC)的测定。筛选出的RA和E.coli试验菌株,进行混合传代培养,因RA培养对营养条件要求比较高,需摸索两种菌混合传代培养的条件。最终确定混合传代培养条件:RA和E.coli先单独培养;混合培养第一代,取10μL E.coli菌悬液(浓度为1.5×103 CFU/mL)与50μL RA菌悬液(浓度为15×108 CFU/mL)接种在4 mL含4%血清的胰蛋白胨大豆肉汤TSB培养基中,混合培养9~12 h;从混合培养第二代开始,取10μL混合培养上一代菌液(浓度为1.5×105 CFU/mL)与50μL RA菌液(浓度为15×108 CFU/mL)接种在4 mL含4%血清的TSB培养基中,混合培养9~12 h。混合传代培养后耐药性大肠杆菌的筛选,吸取每一代的混合培养菌液涂布高于E.coli标准株8099两倍最低抑菌浓度的麦康凯抗性筛选板,环丙沙星(0.25μg/mL)、氧氟沙星(1μg/mL)、诺氟沙星(1μg/mL)抗性板上均无菌生长,卡那霉素(32μg/mL)、庆大霉素(10μg/mL)、妥布霉素(8μg/mL)抗性板上有单个菌落,分别命名为E1、E2、E3。混合传代培养前后耐药性分析,筛选到的大肠杆菌耐药菌株E1、E2、E3对上述6种抗生素进行药物敏感试验和最低抑菌浓度的测定,与大肠杆菌标准株8099相比,耐药菌株E1对氨基糖苷类的庆大霉素、妥布霉素和卡那霉素敏感性显著变化,最低抑菌浓度也显著的增加。为了进一步研究RA与E.coli间耐药性的水平传递,选取氨基糖苷类耐药基因,氨基糖苷乙酰转移酶基因aac6-Ⅰ及aac3-Ⅱ、氨基糖苷腺苷转移酶基因aadA1、氨基糖苷磷酸转移酶基因aph3-Ⅱ设计引物,利用PCR方法对RA P3菌株、E.coli标准株8099及筛选到的大肠杆菌耐药株E1进行检测和序列测定。结果显示,RA P3菌株及筛选的E.coli耐药菌株E1均检测到了基因aac6-Ⅰ,其他基因均未检测到。大肠杆菌标准株8099未检测到任何耐药基因。本研究对鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌成功进行了混合传代培养,同时对混合传代培养前后耐药性进行了分析,确定了RA与E.coli间耐药性的水平传递,为在此研究的基础上进行敏感药物筛选和新药研发打下了基础。
【关键词】：鸭疫里默氏菌 大肠杆菌 混合传代培养 耐药性传递
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 第一章 综述9-19
• 1. 鸭疫里默氏菌研究概述9-11
• 2. 禽大肠杆菌病研究11-13
• 3. 细菌耐药性研究13-16
• 4. 细菌共感染耐药性转移研究16-17
• 5. 选题依据及研究意义17-19
• 第二章 临床鸭疫里默氏菌的分离鉴定及试验菌株的选择19-30
• 1. 材料19
• 2. 方法19-22
• 3. 结果22-27
• 4. 讨论27-30
• 第三章 鸭疫里默氏菌和大肠杆菌体外混合传代培养及耐药菌株的筛选30-36
• 1. 材料30
• 2. 方法30-32
• 3. 结果32-34
• 4. 讨论34-36
• 第四章 体外混合传代前后耐药性分析36-46
• 1. 材料36
• 2. 方法36-39
• 3. 结果39-43
• 4. 讨论43-46
• 结论46-48
• 参考文献48-54
• 附录54-58
• 攻读硕士学位期间发表的文章及专利58-60
• 致谢60

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本文编号：875726