吕氏泰勒虫TISP蛋白与绵羊淋巴细胞互作蛋白的酵母双杂交系统筛选

发布时间：2017-09-19 18:11

  本文关键词：吕氏泰勒虫TISP蛋白与绵羊淋巴细胞互作蛋白的酵母双杂交系统筛选

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【摘要】：吕氏泰勒虫是经蜱传播的寄生于绵羊和山羊巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内的泰勒科泰勒属的一种血液性原虫。TlSP蛋白是吕氏泰勒虫在子孢子、裂殖体及裂殖子三个阶段中共有的一种膜蛋白。吕氏泰勒虫TlSP基因与环形泰勒虫TaSP基因在核苷酸水平上相似性为97%。大量数据显示TaSP蛋白在环形泰勒虫入侵牛淋巴细胞和使牛淋巴细胞永生化中发挥重要的作用,证明其是寄生虫侵袭宿主细胞的主要蛋白。我们推测,TlSP蛋白在吕氏泰勒虫入侵绵羊和山羊等宿主动物中也应该发挥类似的作用。本研究以TlSP蛋白为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术从羊淋巴细胞文库中调出与其相互作用的蛋白,通过研究相互作用蛋白的功能,探究出吕氏泰勒虫TlSP蛋白与虫体入侵宿主细胞的关系。在酵母双杂交筛选蛋白前,以健康绵羊外周淋巴细胞构建酵母双杂交文库,结果显示该文库的细胞密度为1.08x109个/mL,插入片段长度位于250～2000 bp之间,文库滴度为1.09x 108 CFU,重组率为92%,通过测序分析到该文库包括11种以上的淋巴细胞蛋白。对pGBKT7-TlSP诱饵菌的毒性和自启动性进行检测,显示该诱饵对酵母菌没有毒性,且其本身不存在自启动性,TlSP蛋白可以作为酵母双杂交的诱饵蛋白。以TlSP蛋白绵羊免疫血清为一抗,将pGBKT7-TlSP诱饵菌的全蛋白进行Western-blotting.后,发现TlSP蛋白在酵母中能正常表达,其反应原性良好。以pGBKT7-TlSP酵母菌为诱饵,对羊淋巴细胞酵母双杂交文库进行杂交筛选,结果共筛选到9种蛋白,利用生物信息学分析显示这些蛋白大多为核糖体蛋白和剪接体,主要参与调控基因转录、mRNA翻译、细胞增殖、分化和凋亡等过程。将筛选到的核糖体蛋白S20和TlSP蛋白分别通过双酶切连接于pGEX-4T-1和pET-30a表达载体。将pET-30a-TlSP重组蛋白通过镍柱纯化,与pGEX-4T-1-S20重组蛋白进行免疫共沉淀试验后,通过Western-blotting显示核糖体蛋白S20和TlSP蛋白之间确实存在蛋白的相互作用。本研究通过分析用酵母双杂交技术筛选与TlSP互作蛋白的作用,证明TlSP蛋白与TaSP蛋白一样,与其在宿主细胞内的增殖相关,其详细的生物学功能有待进一步的研究。
【关键词】：吕氏泰勒虫 TISP蛋白 绵羊淋巴细胞 酵母双杂交系统 原核表达 免疫共沉淀
【学位授予单位】：西北民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.26
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第1章 前言11-22
• 1.1 羊泰勒虫病的概况11-15
• 1.1.1 羊泰勒虫的分类11
• 1.1.2 羊泰勒虫生活史11-12
• 1.1.3 临床症状及病理变化12-13
• 1.1.4 羊泰勒虫宿主多样性13
• 1.1.5 流行病学特点13-14
• 1.1.6 预防和治疗14-15
• 1.2 羊泰勒虫蛋白组学的概况15-16
• 1.2.1 尤氏泰勒虫TuIP蛋白和Tu88蛋白15
• 1.2.2 尤氏泰勒虫OPRT蛋白15-16
• 1.2.3 羊泰勒虫表面蛋白P32和T1SP蛋白16
• 1.3 环形泰勒虫裂殖体TaSP蛋白16-19
• 1.4 酵母双杂交系统研究进展19-21
• 1.4.1 酵母双杂交的原理19-20
• 1.4.2 酵母双杂交的特点及应用20-21
• 1.5 本研究的目的和意义21-22
• 第2章 正常羊淋巴细胞酵母双杂交文库的构建22-30
• 2.1 材料与方法22-25
• 2.1.1 实验动物22
• 2.1.2 主要试剂及其配制22
• 2.1.3 主要仪器22
• 2.1.4 正常羊淋巴细胞的制备22-23
• 2.1.5 羊淋巴细胞总RNA的提取23
• 2.1.6 羊淋巴细胞ds cDNA的合成及纯化23-24
• 2.1.7 酵母菌Y187感受态细胞的制备24
• 2.1.8 酵母双杂交cDNA文库的构建24-25
• 2.1.9 文库质量的评价25
• 2.2 结果25-28
• 2.2.1 正常羊淋巴细胞总RNA的提取25-26
• 2.2.2 双链cDNA的扩增及其纯化26-27
• 2.2.3 酵母双杂交文库质量的鉴定27-28
• 2.3 小结与分析28-30
• 第3章 酵母双杂交pGBKT7-T1SP诱饵质粒的构建及鉴定30-37
• 3.1 材料与方法30-33
• 3.1.1 菌株30
• 3.1.2 主要试剂及其配制30
• 3.1.3 主要仪器30-31
• 3.1.4 构建pGBKT7-T1SP诱饵载体31-32
• 3.1.5 酵母Y2H株感受态细胞的制备32
• 3.1.6 诱饵pGBKT7-T1SP质粒的转化32
• 3.1.7 诱饵pGBKT7-T1SP质粒的细胞毒性检测32
• 3.1.8 诱饵pGBKT7-T1SP质粒的自启动性检测32
• 3.1.9 诱饵pGBKT7-T1SP质粒真核表达反应原性检测32-33
• 3.2 结果33-35
• 3.2.1 重组pGBKT7-T1SP质粒的构建33
• 3.2.2 重组pGBKT7-T1SP质粒细胞毒性检测33-34
• 3.2.3 重组pGBKT7-T1SP质粒自启动性检测34
• 3.2.4 重组pGBKT7-T1SP质粒蛋白的反应原性检测34-35
• 3.3 小结与分析35-37
• 第4章 酵母双杂交系统筛选与T1SP相互作用的蛋白37-43
• 4.1 材料与方法37-39
• 4.1.1 菌株37
• 4.1.2 主要试剂37
• 4.1.3 主要仪器37
• 4.1.4 酵母双杂交系统互作蛋白对照实验37
• 4.1.5 用pGBKT7-T1SP菌株从羊淋巴细胞酵母双杂交文库中筛选相互作用蛋白37-38
• 4.1.6 阳性克隆测序鉴定38
• 4.1.7 回交验证38-39
• 4.2 结果39-42
• 4.2.1 对照实验39
• 4.2.2 筛选与T1SP蛋白互作的羊淋巴细胞蛋白39-40
• 4.2.3 阳性质粒测序结果40-41
• 4.2.4 回交验证41-42
• 4.3 小结与分析42-43
• 第5章 GST Pull-down法验证S20蛋白与T1SP蛋白的相互作用43-48
• 5.1 材料与方法43-45
• 5.1.1 主要试剂及其配制43
• 5.1.2 主要仪器43
• 5.1.3 pGEX-4T-1-S20表达载体的构建43-44
• 5.1.4 pET-30a-T1SP蛋白的纯化44
• 5.1.5 pGEX-4T-1-S20重组蛋白的诱导表达44
• 5.1.6 Pull-down法验证互作蛋白44-45
• 5.2 结果45-47
• 5.2.1 pGEX-4T-1-S20重组蛋白的诱导表达45
• 5.2.2 Pull-down法验证互作蛋白45-47
• 5.3 小结与分析47-48
• 第6章 全文结论48-49
• 参考文献49-56
• 附录56-58
• 作者简介58
• 硕士生期间发表论文情况58-59
• 致谢59

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本文编号：883136