牛乳头状瘤病毒13型L1基因的表达研究

发布时间：2017-09-20 12:32

  本文关键词：牛乳头状瘤病毒13型L1基因的表达研究

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【摘要】：牛乳头状瘤病毒(bovine papillomavirus, BPV)可引起牛乳头状瘤(bovine papillomatosis, BP)慢性增生性疾病。BPV基因组包括三个区域：早期转录区(E区)、晚期转录区(L区)和非编码区(NCR)。其中,L区主要编码衣壳蛋白,诱导机体产生中和性抗体,激发保护性免疫,是进行预防免疫的主要靶抗原。目前,对于BPV的免疫是建立在L1基因基础上的病毒样颗粒(VLP)预防性免疫,VLP虽具有较好的效果,但价格昂贵。本研究实验一以BPV13基因组为模板,通过PCR技术扩增得到L1片段,同时用BamHⅠ和HindⅢ分别对目的片段和pET28a(+)载体进行双酶切,将酶切后的L1基因片段克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-L1重组质粒,双酶切和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选最佳IPTG浓度和最佳诱导时间,进行诱导表达,以SDS-PAGE和Western blotting检测。将表达的融合蛋白进行Ni-NTA柱纯化后,用SDS-PAGE检测纯化的表达产物。结果表明：L1基因正确插入到原核表达载体pET28a(+)中；IPTG诱导后,含重组质粒pET28a-L1的表达菌成功表达了带His标签的融合蛋白,SDS-PAGE电泳结果显示,融合蛋白分子质量为60 kDa,与预期大小一致,超声破菌后,SDS-PAGE电泳显示,融合蛋白存在于包涵体中；Western blotting验证其为带His标签的融合蛋白。实验二用纯化的融合蛋白皮下多点注射免疫大白兔,制备兔抗BPV13-L1多克隆抗体。用间接ELISA方法检测多抗的效价,结果表明,获得的抗体效价在1：25600以上。Western blotting分析显示：此多抗具有较强的特异性。实验三通过PCR反应扩增L1基因,同时用Xho Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切目的片段和pEGFP-Nl真核载体,连接构建重组表达质粒,转染NIH3T3细胞,进行荧光显微镜观察, qRT-PCR检测和Western blotting鉴定。结果表明：本实验成功构建了pEGFP-N1-L1重组质粒,表达了L1融合蛋白,为BPV13疫苗的开发奠定了基础。
【关键词】：牛乳头状瘤病毒 L1基因 原核表达 纯化 多克隆抗体 真核表达
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 引言9-20
• 1 前言9
• 2 BPV9-17
• 2.1 BPV的类型9-11
• 2.2 BPV基因组结构特点11-16
• 2.3 BPV的致病机制和免疫机理16
• 2.4 不同BPV所致的肿瘤类型16-17
• 3 BP的流行病学17
• 4 BP的诊断与防治17-19
• 4.1 BP的诊断17-18
• 4.2 BP的防治18-19
• 5 研究目的与意义19-20
• 第二章 BPV13 L1基因的克隆、原核表达及纯化20-39
• 1 实验材料20-27
• 1.1 基因组、质粒及菌株20
• 1.2 主要试剂20-21
• 1.3 实验仪器设备21
• 1.4 主要试剂配制21-27
• 2 实验方法27-33
• 2.1 原核表达质粒pET28a-L1的构建及鉴定27-30
• 2.2 原核表达质粒pET28a-L1的表达及优化30-31
• 2.3 重组表达蛋白的纯化和鉴定31-33
• 3 实验结果33-37
• 3.1 L1基因PCR结果33-34
• 3.2 菌落PCR鉴定原核表达质粒pET28a-L134
• 3.3 pET28a-L1重组质粒双酶切鉴定及测序34-35
• 3.4 原核表达质粒pET28a-L1的诱导表达及表达条件优化35
• 3.5 L1重组蛋白的可溶性分析35-36
• 3.6 L1重组蛋白的纯化36
• 3.7 L1重组蛋白的Western blotting分析36-37
• 4 讨论37-39
• 第三章 兔抗BPV13-L1多克隆抗体的制备和应用39-45
• 1 实验材料39-40
• 1.1 主要实验器械39
• 1.2 主要试剂39
• 1.3 实验动物39
• 1.4 实验仪器设备39-40
• 1.5 主要试剂配制40
• 2 实验方法40-42
• 2.1 阴性血清采集40
• 2.2 免疫原的制备40-41
• 2.3 抗L1多克隆抗体的制备41
• 2.4 效价测定41-42
• 2.5 特异性鉴定42
• 3 实验结果42-43
• 3.1 抗L1多克隆抗体效价检测42
• 3.2 抗L1多克隆抗体特异性鉴定42-43
• 4 讨论43-45
• 第四章 BPV13 L1蛋白在NIH3T3细胞中的表达45-58
• 1 实验材料45-47
• 1.1 细胞、菌种和载体45
• 1.2 主要试剂45-46
• 1.3 实验仪器设备46
• 1.4 主要试剂配制46-47
• 2 实验方法47-53
• 2.1 真核表达质粒pEGFP-N1-L1的构建及鉴定47-49
• 2.2 NIH3T3细胞的复苏、培养和冻存49
• 2.3 提取无内毒素真核表达质粒pEGFP-N1-L149-50
• 2.4 脂质体介导pEGFP-N1-L1转染NIH3T3细胞50-51
• 2.5 重组蛋白EGFP-L1的表达检测51-53
• 3 实验结果53-57
• 3.1 L1基因PCR结果53-54
• 3.2 真核表达质粒pEGFP-N1-L1的双酶切鉴定及测序54
• 3.3 荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光蛋白表达54-55
• 3.4 荧光定量PCR检测EGFP-L1融合蛋白的表达55-56
• 3.5 Western blotting检测EGFP-L1融合蛋白的表达56-57
• 4 讨论57-58
• 第五章 结论58-59
• 参考文献59-69
• 缩略词69-70
• 致谢70-71
• 附录71-74

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 赵天靖;贾晓晓;史巧芸;郭莳雨;庞峰;朱华培;徐开莲;李亚颖;彭冬梅;李国华;王凤阳;;牛乳头状瘤病毒13型L1基因的克隆及原核表达[J];中国畜牧兽医;2015年09期

2 史巧芸;庞峰;杜丽;王凤阳;;牛乳头瘤病毒的研究进展[J];中国畜牧兽医;2015年06期

3 贺志昊;刘贤侠;乔军;孟庆玲;张再超;杨海波;陈创夫;都曼·努尔坎杰;;奶牛乳头状瘤病理学诊断及病原分子检测研究[J];石河子大学学报(自然科学版);2013年06期

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本文编号：888062