凋亡抑制剂在猪卵母细胞玻璃化冷冻后凋亡模式研究中的应用

发布时间：2017-09-21 01:31

  本文关键词：凋亡抑制剂在猪卵母细胞玻璃化冷冻后凋亡模式研究中的应用

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【摘要】：猪卵母细胞内由于存在大量脂肪颗粒,其冷冻保存现状仍不理想,主要表现为冷冻复苏后发育能力低。因此,研究猪卵母细胞冷冻后损伤机制十分重要。在卵母细胞冷冻保存中,冷冻后复苏过程中发生的细胞凋亡被认为是影响卵母细胞冷冻后发育能力的主要因素之一。然而关于猪卵母细胞冷冻后凋亡报道偏少,尤其是关于猪卵母细胞凋亡途径的研究至今较少。本试验利用玻璃化冷冻技术冷冻猪卵母细胞,在冷冻复苏后孵育过程中分别添加死亡受体介导的外源性凋亡和线粒体介导的内源性凋亡途径中关键因子caspase 8和caspase 9的抑制剂,以及两者共同作用途径中的总caspase抑制剂,从而研究猪卵母细胞冷冻后凋亡途径及抑制剂对猪卵母细胞冻后发育的改善作用。本次试验旨在加深对猪卵母细胞冻后凋亡机理的认识及凋亡抑制剂在哺乳动物卵母细胞凋亡的应用,并为提高猪卵母细胞冻后发育能力提供一定的理论和实验基础。本试验主要包括2个部分:第一部分研究内容是通过将特异性凋亡抑制剂应用于猪卵母细胞冷冻中,探讨其冻后可能的细胞凋亡途径。冷冻引起的凋亡是冻后猪卵母细胞发育下降的主要原因之一,但冷冻凋亡途径还不甚了解。Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK和Z-DEVD-FMK分别是凋亡过程中死亡受体途径、线粒体途径及共同作用途径的关键性凋亡因子caspase8、caspase9和caspase3的特异性抑制剂。为了进一步了解猪MII期卵母细胞冻后凋亡途径,本研究检测了新鲜、冷冻、Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK和Z-DEVD-FMK组的早期凋亡情况,并利用原位荧光、JC-1和RT-PCR技术检测两个凋亡途径中关键蛋白和分子的活性与表达情况,以阐明猪卵母细胞冻后凋亡途径。同时检测了抑制剂的添加对卵母细胞冻后活性和发育能力的影响。研究结果显示,1)冷冻造成卵母细胞早期凋亡,两种抑制剂降低冷冻卵母细胞早期凋亡率(P0.05);2)与冷冻组相比,Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK和Z-DEVD-FMK均显著降低冷冻卵母细胞中总caspase、caspase3,caspase8和caspase9的活性;3)冷冻后线粒体膜电位显著降低(0.90 vs.1.33,P0.05),Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK和Z-DEVD-FMK添加能显著提高线粒体膜电位(1.09、1.05和1.11);4)冻后Z-IETD-FMK的添加能改善死亡受体途径中相关基因(caspase8和TNF-α)和线粒体途径中相关基因(Bcl-2和CuZnSOD)的表达,Z-LEHD-FMK的添加亦改变两个凋亡途径中相关基因的表达,Z-DEVD-FMK能改善两条途径中凋亡基因的表达;5)Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK和Z-DEVD-FMK显著提高卵母细胞冻后存活率、卵裂率和囊胚率。第二部分研究内容是分析总caspase抑制剂Z-VAD-FMK对猪卵母细胞冷冻后凋亡及发育的影响。Z-VAD-FMK是一种caspase广谱抑制剂,为了研究pan-caspase抑制剂Z-VAD-FMK在猪冷冻卵母细胞的作用,本文利用Annexin-V FITC、JC-1、caspase原位荧光染色分别检测早期凋亡、线粒体膜电位和caspase水平,并利用相对荧光定量PCR技术检测不同凋亡途径中相关基因的表达变化,同时检测冷冻卵母细胞孤雌激活后的卵裂率和囊胚率。结果表明:Z-VAD-FMK组与冷冻组相比,细胞凋亡率和总caspase水平明显降低(P0.05),线粒体膜电位明显提高(P0.05),但与新鲜组相比,细胞凋亡率和总caspase水平仍旧明显偏高(P0.05),线粒体膜电位明显低(P0.05);冷冻后加Z-VAD-FMK组孤雌激活后其卵裂率和囊胚率明显高于冷冻组(P0.05),低于新鲜组(P0.05);Z-VAD-FMK明显降低冷冻细胞中caspase3、8、9,Bax,TNF-α等促凋亡基因水平(P0.05),抗凋亡基因Bcl-2和CuZnSOD表达水平明显升高(P0.05)。结论:总之,凋亡抑制剂的添加从侧面证实了死亡受体介导的外源性凋亡途径和线粒体介导的内源性凋亡途径共同介导了冻后猪MII期卵母细胞凋亡的发生;冻后猪卵母细胞在Z-VAD-FMK中孵育2 h可以提高线粒体膜电位,抑制细胞凋亡,改善凋亡相关基因表达,提高冷冻卵母细胞孤雌发育能力。
【关键词】：猪 卵母细胞 玻璃化冷冻 凋亡抑制剂 凋亡途径 发育
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 引言12-21
• 1.1 种质资源保存12-15
• 1.1.1 种质资源保存的方法12-13
• 1.1.2 卵母细胞冷冻保存现状13-14
• 1.1.3 卵母细胞冷冻保存困难14-15
• 1.2 细胞凋亡15-21
• 1.2.1 死亡受体途径16
• 1.2.2 线粒体途径16-17
• 1.2.3 哺乳动物卵母细胞凋亡的研究现状17-19
• 1.2.4 冷冻对哺乳动物卵母细胞凋亡的影响19
• 1.2.5 凋亡抑制剂在细胞凋亡中的应用19-21
• 第二章 特异性凋亡抑制剂在冷冻猪卵母细胞凋亡途径中的应用21-38
• 2.1 材料21-26
• 2.1.1 主要试剂21-23
• 2.1.2 设备与耗材23-24
• 2.1.3 试剂的配制24-26
• 2.3 方法26-29
• 2.3.1 采集和体外成熟培养26
• 2.3.2 玻璃化冷冻和解冻26
• 2.3.3 早期凋亡的测定26-27
• 2.3.4 caspase水平的测定27
• 2.3.5 线粒体膜电位的测定27
• 2.3.6 总RNA提取27
• 2.3.7 反转录27-28
• 2.3.8 荧光定量PCR（ qRT- PCR）28
• 2.3.9 猪卵母细胞冻后存活率的测定28-29
• 2.3.10 冷冻猪卵母细胞体外发育能力的测定29
• 2.3.11 数据统计29
• 2.4 结果与分析29-35
• 2.4.1 凋亡抑制剂对玻璃化冷冻猪卵母细胞早期凋亡的影响29-30
• 2.4.2 凋亡抑制剂对玻璃化冷冻猪卵母细胞中caspase活性的影响30-32
• 2.4.3 凋亡抑制剂对玻璃化冷冻猪卵母细胞线粒体膜电位的影响32-33
• 2.4.4 凋亡抑制剂对玻璃化冷冻猪卵母细胞中凋亡基因表达的影响33-34
• 2.4.5 凋亡抑制剂对玻璃化冷冻猪卵母细胞存活率和孤雌激活发育能力的影响34-35
• 2.5 讨论35-37
• 2.6 小结37-38
• 第三章 凋亡抑制剂Z-VAD-FMK在猪卵母细胞冷冻保存中的应用38-48
• 3.1 材料38
• 3.1.1 仪器38
• 3.1.2 主要试剂38
• 3.1.3 试剂配制38
• 3.2 方法38-40
• 3.2.1 采集和体外成熟培养38-39
• 3.2.2 玻璃化冷冻和解冻39
• 3.2.3 早期凋亡检测39
• 3.2.4 caspase活性的检测39
• 3.2.5 线粒体膜电位检测39
• 3.2.6 总RNA提取39
• 3.2.7 反转录39
• 3.2.8 qRT- PCR39-40
• 3.2.9 冻后存活率的测定40
• 3.2.10 孤雌发育能力的测定40
• 3.2.11 数据统计40
• 3.3 结果与分析40-45
• 3.3.1 Z-VAD-FMK对猪冷冻卵母细胞早期凋亡率的影响40-41
• 3.3.2 Z-VAD-FMK对冷冻猪MII期卵母细胞内caspase活性的影响41-42
• 3.3.3 Z-VAD-FMK处理对猪冷冻卵母细胞线粒体膜电位的影响42-43
• 3.3.4 Z-VAD-FMK对猪冷冻卵母细胞凋亡相关基因表达的影响43-44
• 3.3.5 冻后Z-VAD-FMK对猪冷冻卵母细胞存活率和体外发育能力的影响44-45
• 3.4 讨论45-46
• 3.5 小结46-48
• 参考文献48-57
• 附录57-59
• 致谢59-60
• 成果60

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