H9N2亚型禽流感病毒的序列分析及其生物学特性研究

发布时间：2017-09-21 06:42

  本文关键词：H9N2亚型禽流感病毒的序列分析及其生物学特性研究

  更多相关文章： H9N2亚型禽流感病毒 分离鉴定 抗原变异 传播特性 致病性

【摘要】：禽流感(Avian Influenza)是由A型流感病毒引起的一种禽类的病毒性传染病。H9N2亚型禽流感病毒是最常见的低致病性禽流感病毒,最早于1966年从北美的火鸡体内分离得到,此后相继在世界其他地方被发现,并呈广泛流行的态势,危害持久不易控制,给养禽业造成严重的经济损失。值得注意的是,H9N2亚型禽流感病毒在家禽中偶尔会传播到哺乳动物中,包括人类和猪,也是97年香港禽流感感染人的H5N1禽流感病毒的内部基因的供体。因此,具有潜在导致新型流感的大流行。本试验从2011年起至2014年在本校附属动物医院以及活禽市场定期采集病料,对所采集的病料进行分离鉴定,并从每年所鉴定出的H9N2亚型禽流感病毒中各选取2株H9N2亚型禽流感病毒毒株,研究不同年间H9N2亚型禽流感病毒株之间抗原差异性以及生物学特性。1.H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定本试验在扬州大学动物医院以及江苏省扬州市活禽市场定期采集病料,对所采集的病料进行分离鉴定,对鉴定的H9亚型病毒,按照分离的年代,选择每年2株病毒制作鸡源高免血清和EIDso检测,测定分离株之间的交叉HI效价,分析分离株之间的抗原性关系。分离株与Ck/GD/SS/94和Ck/SH/F/98株多抗血清的H1检测结果显示,2011年至2014年的分离株大多与Ck/GD/SS/94和Ck/SH/F/98株的多抗血清的有较好的反应,表明大部分分离株的抗原性与Ck/GD/SS/94或Ck/SH/F/98的抗原性差异性不大；而分离株Ck/HB/11、 Ck/JS/TM58/13和Ck/JS/JT95/13与Ck/GD/SS/94株的多抗血清的HI效价小于8：分离株Ck/SD/C9QH/11株与Ck/SH/F/98株的多抗血清的HI效价小于8：表明Ck/HB/11、 Ck/JS/TM58/13和Ck/JS/JT95/13与Ck/GD/SS/94株、Ck/SD/C9QH/11与Ck/SH/F/98株的抗原性有显著差异；此外,交叉血凝抑制实验结果发现,大部分分离株与Ck/SD/C9QH/11和Ck/JS/JT95/13的血清不反应,而与2013-2014年分离株的多抗血清有较好的HI效价,表明近几年分离株的血清能够抑制早期的分离株,分离株的抗原性随着时间推移发生了变异。从病毒在MDCK细胞的TCID50的结果来看,大部分分离株与Ck/SH/F/98毒株的TCID50相似,而Ck/JS/ZJ618/12、Ck/YZ640/12和Ck/AH/WB/14毒株感染细胞的能力较弱,其机制有待进一步研究。2.分离株HA基因及部分分离株全基因序列分析为进一步研究H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化规律,本试验对分离的29株H9亚型禽流感病毒的HA基因进行测序和分析,同时选择其中的8株病毒进行全基因序列的测定测序。序列分析结果显示,29株分离株的HA基因都属于Ck/JS/1/00-like分支亚系,即Beijing/94-like分支；但又与Beijing/94-like存在一定的差异性,同时也能看出大部分浙江、山东、江苏来源的分离株都属于同一分支。分离株血凝素裂解位点335-338位的氨基酸序列大部分是R-S-S-R, Ck/JS/YZ150/12、Ck/JS/YZ667/12、Ck/HLJ/DD/11、Ck/HB/11 Ck/JS/JT12/11株的氨基酸序列为K-S-S-R,即为典型的低致病性禽流感病毒特征性序列；29株分离株大部分在HA蛋白含有8个潜在糖基化位点；与Ck/SH/F/98株的HA基因比较,近几年分离株在220位发生氨基酸了T→1或者T→V的变化：分离株HA基因的受体结合位点的7个关键性氨基酸残基中的190位氨基酸残基的变异频繁。本试验中所有分离株的234位氨基酸残基都是与Neu5Aca2-6Gal的受体结合特性有关的Leu。8个代表株中有7株的NA基因基本来自Beijing/94-like分支,并且NA基因氨基酸位点大部分高度保守,仅近年的分离株NA基因多了2个潜在糖基化位点。分离株的NP、NS、PB1基因属于Ck/SH/F/98-like亚系。M基因属于Qa/HK/G1/97-like亚系。PB2与PA基因属于G9/97-like亚系。Ck/JS/TM58/13、Ck/JS/JT95/13、Ck/JS/TM71/14株的NP基因与Ck/JS/SC537/13(H7N9)株的同源性非常高,表明目前鸡源H9N2亚型禽流感病毒是G9-like、F/98-like和G1-like的重组体,并且是H7N9禽流感病毒内部基因的供体。3.分离株致病特性及其传播特性研究本实验拟将选择的8株H9N2亚型禽流感病毒毒株(Ck/SD/C9QH/11、Ck/JS/JT12/11、 Ck/JS/ZJ618/12、Ck/JS/YZ640/12、Ck/JS/TM58/13、Ck/JS/JT95/13、Ck/AH/WB/14 Ck/JS/TM71/14)和经典毒株Ck/SH/F/98进行致病性和传播特性研究。将120只3周龄的SPF鸡分为10大组,每组12只；其中一组为空白对照组,不接种任何病毒；其余9大组分别进行一株H9N2亚型禽流感病毒的致病性和传播特性的研究；每组中6只鸡,接种病毒作为攻毒组,3只鸡与攻毒鸡同笼饲养作为直接接触组,3只鸡置于距离攻毒鸡50 cm处的另一笼子饲养作为气溶胶传播组,不接种病毒；在攻毒组攻毒后第3、5天,对攻毒组、直接接触组和气溶胶传播组分别采集实验鸡的气管和泄殖腔棉拭子以分离病毒,同时对攻毒组鸡每次扑杀3只攻毒,取其气管和肺进行组织病理学的观察；结果发现,所选择的代表株对鸡都有气溶胶传播的特性；分离株在鸡气管中的复制能力都强于在肺组织中的复制能力,其中Ck/JS/ZJ618/12株比其余毒株在肺组织中的复制能力强；显微病理变化结果显示,2013年和2014年分离株感染鸡第5d比第3d的气管病理变化严重,而2011-2012年分离株感染鸡第5d比第3d的肺组织病理变化严重。结果表明,2011-2014年分离株对鸡都具有气溶胶传播特性；近3年分离株在气管中的复制和致病能力都强于在肺组织中的复制和致病能力,其分子机制还有待进一步研究。
【关键词】：H9N2亚型禽流感病毒 分离鉴定 抗原变异 传播特性 致病性
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要3-6
• Abstract6-12
• 符号说明12-13
• 第一部分 文献综述13-25
• 1 我国H9N2亚型禽流感病毒的历史和流行病学13-15
• 2 H9N2亚型禽流感病毒在鸡的临床症状15
• 3 我国H9N2亚型禽流感病毒抗原漂移15-16
• 4 我国H9N2亚型禽流感病毒种间传播16-18
• 5 我国H9N2亚型禽流感病毒的遗传和生物进化18-19
• 6 H9N2亚型禽流感病毒在动物模型的毒力,传递和分子机制19-20
• 7 H9N2基因供体的新型流感病毒20-21
• 参考文献21-25
• 第二部分 论文试验25-73
• 第一章 H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定25-37
• 1 材料25-27
• 1.1 病料来源以及病毒25
• 1.2 SPF鸡胚、试验动物25
• 1.3 试剂25-26
• 1.4 试剂配制26
• 1.5 主要仪器设备26-27
• 2 方法27-29
• 2.1 流行病学调查27
• 2.2 病毒的分离与鉴定27
• 2.2.1 病料处理27
• 2.2.2 鸡胚接种27
• 2.2.3 血凝、血凝抑制试验27
• 2.3 纯化并扩增病毒27
• 2.4 H9N2亚型禽流感病毒油乳剂疫苗制备27-28
• 2.5 H9N2亚型血清制备28
• 2.6 HI交叉试验28
• 2.7 病毒鸡胚半数感染量(EID_(50))和鸡胚半数致死量(ELD_(50))测定28-29
• 2.8 半数细胞培养感染剂量(TCID_(50))测定29
• 2.8.1 MDCK细胞的制备29
• 2.8.2 病毒的稀释29
• 2.8.3 接种病毒29
• 3 结果29-35
• 3.1 病毒分离与鉴定29-30
• 3.2 HI交叉试验30-34
• 3.3 分离株EID_(50)、ELD_(50)和TCID_(50)的测定34-35
• 4 讨论35-36
• 参考文献36-37
• 第二章 分离株HA基因及部分分离株全基因测序分析37-56
• 1 材料37-38
• 1.1 病毒37
• 1.2 SPF鸡胚37
• 1.3 试剂37
• 1.4 试剂配制37-38
• 1.5 主要仪器设备38
• 2 方法38-41
• 2.1 纯化并扩增病毒38
• 2.2 扩增病毒HA基因片段并测序38-39
• 2.2.1 反转录引物设计38
• 2.2.2 HA基因RT-PCR引物设计38-39
• 2.2.3 病毒RNA提抽39
• 2.2.4 HA基因的扩增39
• 2.2.5 1%琼脂糖凝胶电泳39
• 2.3 扩增病毒全基因片段并测序39-41
• 2.3.1 反转录引物设计39
• 2.3.2 全基因RT-PCR引物设计39-40
• 2.3.3 病毒RNA提抽40
• 2.3.4 全基因的扩增40-41
• 2.3.5 1%琼脂糖凝胶电泳41
• 2.4 序列分析41
• 3 结果41-55
• 3.1 分离株HA基因扩增和测序41-46
• 3.1.1 RT-PCR扩增41-42
• 3.1.2 分离株HA基因遗传进化分析42-43
• 3.1.3 分离株HA基因核苷酸同源性分析43
• 3.1.4 分离株HA氨基酸变异分析43-46
• 3.2 8株分离株区域7个基因序列比较46-55
• 3.2.1 RT-PCR扩增46-47
• 3.2.2 PB2基因分析47
• 3.2.3 PB1基因分析47-48
• 3.2.4 PA基因分析48-49
• 3.2.5 NP基因分析49-50
• 3.2.6 NA基因50-53
• 3.2.7 M基因分析53
• 3.2.8 NS基因分析53-55
• 4 讨论55
• 参考文献55-56
• 第三章 分离株致病性及其传播特性研究56-73
• 1 材料56-57
• 1.1 病毒56
• 1.2 SPF鸡胚、试验动物56
• 1.3 试剂56-57
• 1.4 试剂配制57
• 1.5 主要仪器设备57
• 2 方法57-59
• 2.1 病毒的纯化与扩增57
• 2.2 病毒对鸡致病性试验57-59
• 2.2.1 动物试验分组57-58
• 2.2.2 病毒处理、接种与检测58-59
• 2.2.3 石蜡切片的制作59
• 3 结果59-70
• 3.1 分离株的复制与传播59-61
• 3.1.1 分离株感染鸡后气管和泄殖腔棉拭子病毒分离59-60
• 3.1.2 分离株感染鸡后气管和肺组织内病毒EID_(50)和ELD_(50)60-61
• 3.2 病理变化61-70
• 4 讨论70-71
• 参考文献71-73
• 全文小结73-74
• 致谢74-75

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 卢建红,刘秀梵,邵卫星,张评浒,韦栋平;H9N2亚型禽流感病毒基因组全长序列测定和各基因的遗传分析[J];微生物学报;2003年04期

2 程坚,刘红旗,彭大新,张如宽,刘秀梵;两株H_9亚型禽流感病毒HA基因序列分析[J];江苏农业研究;2001年01期

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本文编号：893000