猪肠黏膜保护因子的短小芽孢杆菌表达系统建立

发布时间：2017-09-22 04:06

  本文关键词：猪肠黏膜保护因子的短小芽孢杆菌表达系统建立

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【摘要】：仔猪腹泻的发生主要由肠黏膜屏障功能受损引起。抗分泌因子(Antisecretory factor,AF)、血红素加氧酶-1(Heme oxygenase,HO-1)、肠三叶肽因子(Trefoil factor family 3,TFF3)能修复上皮细胞损伤,在肠黏膜屏障功能维持中发挥重要作用。短小芽孢杆菌表达系统能高效分泌表达外源蛋白,且不产生内毒素,能调节肠道的微生态平衡。自然分离肠黏膜保护因子的成本高、产量和活性较低,很难直接用于工业化生产或作为饲料添加剂使用。本文旨在建立猪肠黏膜保护因子(AF、HO-1、TFF3)的短小芽孢杆菌表达系统,为降低仔猪腹泻发生、保护肠黏膜屏障提供新思路和新方法。利用PCR方法从猪组织中克隆AF、HO-1、TFF3基因,以pNCMO2为载体分别构建重组表达载体pNCMO2-TFF3、pNCMO2-HO-1、pNCMO2-AF,利用电转的方法将重组表达载体pNCMO2-TFF3、pNCMO2-HO-1、pNCMO2-AF转入短小芽孢杆菌,SDS-PAGE和Western Blot方法分析AF、HO-1、TFF3基因在短小芽孢杆菌中的融合表达。结果表明,克隆了猪AF、HO-1、TFF3基因,全长分别为1164bp、897bp、273bp,分别编码387个、298个和87个氨基酸;电泳和测序表明与预期目的基因片段大小一致;成功构建了猪重组表达载体pNCMO2-TFF3、pNCMO2-HO-1、pNCMO2-AF,菌液PCR和双酶切结果鉴定正确;电转后的酶切鉴定结果显示,分别在5200bp处获得pNCMO2载体片段和1164bp、897bp、273bp的目的基因AF、HO-1、TFF3片段;蛋白表达分析SDS-PAGE和Western Blot结果显示,诱导表达蛋白AF、HO-1、TFF3大小分别为46.3KD、36.5KD和13.6KD,与预期大小一致,且为胞外分泌。综上结果提示,成功构建了猪肠黏膜保护因子的芽孢杆菌表达系统,为仔猪腹泻的防治提供了新思路。
【关键词】：肠黏膜保护因子 pNCMO2载体 短小芽孢杆菌 SDS-PAGE Western Blot 诱导表达
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 致谢4-5
• 英文缩略词表5-9
• 摘要9-10
• 1 文献综述10-18
• 1.1 仔猪腹泻10
• 1.2 肠黏膜保护因子10-14
• 1.2.1 抗分泌因子（AF）10-11
• 1.2.1.1 抗分泌因子（AF）结构特点和性质10-11
• 1.2.1.2 抗分泌因子（AF）生理功能11
• 1.2.2 血红素加氧酶（HO）11-13
• 1.2.2.1 血红素加氧酶（HO）结构特点和性质11-12
• 1.2.2.2 血红素加氧酶-1（HO-1）生理功能12-13
• 1.2.3 三叶肽13-14
• 1.2.3.1 三叶肽结构特点和性质13-14
• 1.2.3.2 肠三叶因子(TFF3)生理功能14
• 1.3 短小芽孢杆菌及其表达系统14-17
• 1.3.1 短小芽孢杆菌15-16
• 1.3.1.1 短小芽孢杆菌作为基因工程菌优势15
• 1.3.1.2 短小芽孢杆菌作为益生菌的优势15-16
• 1.3.2 表达载体pNCMO216-17
• 1.4 展望17-18
• 2 引言18-19
• 3 材料与方法19-29
• 3.1 试验材料19
• 3.2 菌株和质粒19
• 3.3 主要试剂19
• 3.4 主要仪器19
• 3.5 常规试剂配制19-22
• 3.5.1 核酸电泳试剂19
• 3.5.2 SDS-PAGE试剂19-20
• 3.5.3 Western Blot试剂20-21
• 3.5.4 培养基配制21
• 3.5.5 抗生素配制21-22
• 3.5.6 其他试剂配制22
• 3.6 猪肠黏膜保护因子的克隆22-24
• 3.6.1 猪AF、HO-1、TFF3基因引物设计22-23
• 3.6.2 RNA提取23
• 3.6.3 cDNA合成23
• 3.6.4 猪AF、HO-1、TFF3基因PCR扩增23-24
• 3.6.5 PCR产物胶回收24
• 3.7 重组表达载体构建24-26
• 3.7.1 猪肠黏膜保护因子连接pMD19-T载体24
• 3.7.2 连接产物转化感受态细胞24
• 3.7.3 阳性克隆菌的筛选与鉴定24-25
• 3.7.4 载体双酶切25
• 3.7.5 酶切产物胶回收25
• 3.7.6 T4 DNA连接酶连接反应25-26
• 3.7.7 阳性克隆菌的筛选与鉴定26
• 3.8 猪肠黏膜保护因子在短小芽孢杆菌中的诱导表达26-29
• 3.8.1 短小芽孢杆菌的电转化26-27
• 3.8.1.1 短小芽孢杆菌的培养26
• 3.8.1.2 短小芽孢杆菌感受态的制备26
• 3.8.1.3 电穿孔转化26-27
• 3.8.1.4 阳性克隆菌的筛选与鉴定27
• 3.8.2 猪AF、HO-1、TFF3基因的诱导表达27
• 3.8.3 样品处理27
• 3.8.4 SDS-PAGE27
• 3.8.5 Western Blot27-29
• 4 结果与分析29-39
• 4.1 猪肠黏膜保护因子的克隆及鉴定29-30
• 4.2 重组表达载体的构建30-33
• 4.2.1 pMD19-T-AF、pMD19-T-HO-1、pMD19-T-TFF3载体构建30-31
• 4.2.2 pNCMO2-AF、pNCMO2-HO-1、pNCMO2-TFF3载体构建31-33
• 4.3 猪肠黏膜保护因子在短小芽孢杆菌中的诱导表达33-39
• 4.3.1 短小芽孢杆菌的培养33
• 4.3.2 短小芽孢杆菌的电转化33-36
• 4.3.3 SDS-PAGE检测猪肠黏膜保护因子的表达36-37
• 4.3.4 Western blot检测猪肠黏膜保护因子的表达37-39
• 5 结论与讨论39-41
• 5.1 讨论39-40
• 5.1.1 猪肠黏膜保护因子基因克隆39
• 5.1.2 猪肠黏膜保护因子短小芽孢杆菌表达系统39-40
• 5.2 结论40-41
• 参考文献41-52
• ABSTRACT52

【参考文献】

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本文编号：898660