我国东北三省蝙蝠病毒组学及其新病毒的鉴定

发布时间：2017-09-23 05:17

  本文关键词：我国东北三省蝙蝠病毒组学及其新病毒的鉴定

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【摘要】：蝙蝠是世界上仅次于啮齿类动物的种类最为丰富的哺乳动物,分布在除两极的所有陆地。同时,蝙蝠又是重要的病毒储存库,能携带至少170种病毒,包括一些人兽共患病毒,如狂犬病毒、亨德拉病毒、埃博拉病毒、博卡病毒等。在我国有120种蝙蝠,分属于12个蝙蝠科30个蝙蝠属,广泛分布在我国的多个地区。东北三省包括辽宁、吉林和黑龙江,与俄罗斯和朝鲜接壤,具有重要的战略地位;该地区地域辽阔,气候独特,蝙蝠资源目前没有系统的数据,而关于我国东北地区蝙蝠携带病毒的数据更是严重缺乏,仅发现了蝙蝠伊库特病毒(Irkut virus,狂犬病毒属成员)、博卡病毒和冠状病毒,因而系统全面调查我国东北三省蝙蝠携带病毒的多样性和遗传多态性,对于了解东北地区蝙蝠病毒的本地情况具有重要的意义。本研究在2013-2014年间,于东北三省实地考察了16个市的蝙蝠生态情况,结果在6个市发现了蝙蝠,其种类主要是马铁菊头蝠、大足鼠耳蝠、白腹管鼻蝠和东方蝙蝠等,我们在这些市设置了10个蝙蝠病毒监测点,共采集了204只蝙蝠样本。通过本实验室已建立的病毒宏基因组学方法对以上样本进行病毒组分析,发现了22个科的病毒,其中注释到脊椎动物病毒有16个科20个属32个种,如白蛉热病毒、α冠状病毒和β冠状病毒、人副流感病毒4型、星状病毒以及博卡病毒等;昆虫病毒6个科,如Baculoviridae、Dicistroviridae、Iflaviridae、Parvoviridae(Ambidensovirus)、Polydnaviridae和Tetraviridaes等;还发现一个植物病毒科,Phycodnaviridae。本研究主要关注脊椎动物病毒,根据病毒宏基因组学分析结果,对星状病毒、水泡性病毒、细小病毒、小RNA病毒、环状病毒、布尼亚病毒、圆环病毒、冠状病毒等进行了鉴定分析。从辽宁省本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠中,有病毒序列注释到了星状病毒科,在这些星状病毒序列中,与不丹国人星状病毒BtnMLB1-86同源性最高,为84%。弹状病毒科中的水疱性病毒序列发现于辽宁本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠中,其中水疱性病毒与美国蝙蝠水疱性病毒TFFN-2013株同源性最高,为64.3%。使用特异性PCR筛查,从辽宁省本溪市溪湖区6只马铁菊头蝠中检测到2只蝙蝠携带水泡性病毒,阳性率为33.3%;从辽宁省本溪市本溪县4只马铁菊头蝠中检测到1只蝙蝠携带水泡性病毒,阳性率为25.0%;从辽宁省本溪市恒仁县2只马铁菊头蝠中全部检测到水泡性病毒,阳性率为100%。小RNA病毒科的心病毒序列发现于吉林省的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠中,其中心病毒序列与刚果蝙蝠环状病毒PREDICT-06105同源性最高,为84%;并在吉林省通化市的28只大足鼠耳蝠中,检测出9只蝙蝠携带有心病毒,阳性率为33.3%。病毒宏基因组学结果中,注释到了细小病毒科博卡细小病毒属和依赖细小病毒属,在吉林省通化市的29只马铁菊头蝠中,检测出19只蝙蝠携带博卡病毒,阳性率为65.5%;在辽宁省本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠、吉林省通化市的白腹管鼻蝠以及黑龙江省的东方蝙蝠中,均发现有病毒序列注释到细小病毒科依赖细小病毒属,这三株细小病毒均与我国蝙蝠腺联病毒ynm株有最高同源,分别为84%、89%以及87%,并且它们均与依赖细小病毒属病毒处在同一进化分支。注释到了呼肠孤病毒科的环状病毒的病毒序列,来源于于辽宁省本溪市的马铁菊头蝠和大足鼠耳蝠中,与澳大利亚环状病毒属的eubenangeevirus具有最高同源性,为79%,并在辽宁省本溪市的29只大足鼠耳蝠中,检测出4只蝙蝠携带有环状病毒,阳性率为13.8%。。同时,这株蝙蝠环状病毒是国内首次从蝙蝠中检测到的。另外,通过特异性pcr验证,从黑龙江省的蝙蝠中,检测到了两株圆环病毒,一株是在哈尔滨市阿城区的43只东方蝙蝠中,检测出2只蝙蝠有圆环病毒基因存在,阳性率为4.7%;另外一株是在大庆市萨尔图区的9只东方蝙蝠中检测到1只蝙蝠携带圆环病毒,阳性率为11.1%。在吉林省通化市的40只白腹管鼻蝠中,检测出2只蝙蝠含有腮腺炎病毒属(rubulavirus)病毒基因,阳性率为5%。从吉林省通化市的29只马铁菊头蝠中,检测到有8只马铁菊头蝠携带有布尼亚病毒基因,阳性率为27.6%。对于冠状病毒的检测,一株是从吉林省通化市的40只白腹管鼻蝠中检测出一只蝙蝠携带α冠状病毒属的冠状病毒基因,阳性率为2.5%,另外一株是从吉林省通化市的29只马铁菊头蝠检测出一只蝙蝠携带有β冠状病毒属的冠状病毒基因,阳性率为3.5%。针对以上鉴定结果,挑取了圆环病毒、布尼亚病毒、副粘病毒和冠状病毒进行了更进一步的研究。对两株圆环病毒进行全基因组学分析,获得了长2117nt和2113nt基因组序列。对基因组预测分析,在复制原点处,均存在茎环结构;还都存在poly(t)结构。系统进化分析,蝙蝠圆环病毒的全基因组序列与圆环病毒属vs7100003株狐狸圆环病毒存在最高同源性,通过系统进化分析,发现也与这株狐狸圆环病毒处在同一进化分支,均为圆环病毒属成员,这是东北三省首次发现蝙蝠圆环病毒。对白蛉热病毒属的这株布尼亚病毒进行分析,发现与我国陕西rp-bunyav/shaanxi2011株蝙蝠布尼亚病毒存在最高同源,并且同处同一进化分支,与白蛉热病毒属病毒近缘,这是东北三省首次发现蝙蝠布尼亚病毒。获得了5318nt长的蝙蝠副粘病毒基因序列,分析发现与人副流感病毒4型具有最高的同源性,并且均处在同一进化分支,均为腮腺炎病毒属病毒,这是东北三省首次发现蝙蝠副流感病毒。在吉林省通化市,获得了jtac2株α冠状病毒和jtmc15株β冠状病毒两株冠状病毒,基因分析发现jtac2株α冠状病毒与我国Neixiang14株冠状病毒具有最高同源性,同时也处在α冠状病毒属内的同一进化分支中;JTMC15株β冠状病毒与Rf1株SARS样冠状病毒具有最高的同源性,均处β冠状病毒属β2群中,均为β冠状病毒属病毒,同时,也发现JTMC15株β冠状病毒存在整个基因8缺失的现象。本研究使用病毒宏基因学方法首次对东北三省的蝙蝠病毒组全面调查,获得了大量的蝙蝠病毒组信息;鉴定了13种脊椎动物病毒,其中包括星状病毒、细小病毒、小RNA病毒、水泡性病毒、环状病毒、圆环病毒、布尼亚病毒、副粘病毒以及冠状病毒等,并对其中圆环病毒、布尼亚病毒、副粘病毒以及冠状病毒进行了进一步分析,获得了圆环病毒和两株冠状病毒全基因组序列。而在这些病毒种,有很多病毒为首次在东北三省发现,比如星状病毒、水泡性病毒、细小病毒、小RNA病毒、布尼亚病毒、圆环病毒、α冠状病毒等。另外,依据病毒宏基因组病毒序列及其注释信息,也能够找出这些病毒序列对应的蝙蝠样品信息,大大提高了对蝙蝠携带病毒信息的发掘效率,体现出了病毒宏基因组学分析的优势性,这也说明病毒宏基因组学分析手段在发现新型病毒的工作中,能够起到突破性的作用。同时也发现了东北三省蝙蝠携带大量的蝙蝠源病毒,获得了东北三省蝙蝠携带病毒的本底数据,也进一步丰富了蝙蝠病毒的数据库,了解了蝙蝠病毒的多样性,系统获得了东北三省蝙蝠携带病毒组的情况。同时,也获得了东北三省蝙蝠栖息环境情况,为以后了解蝙蝠栖息环境提供了基础数据。
【关键词】：东北三省 蝙蝠病毒 病毒宏基因组学分析 病毒鉴定
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 缩略词7-9
• 伦理证明9-10
• 摘要10-13
• Abstract13-17
• 前言17-19
• 第一章 东北三省蝙蝠病毒宏基因组学研究19-49
• 1.1 材料19-23
• 1.1.1 蝙蝠样本19-22
• 1.1.2 主要试剂及耗材22
• 1.1.3 实验仪器22
• 1.1.4 生物信息学软件22-23
• 1.2 方法23-27
• 1.2.1 蝙蝠种类鉴定23-24
• 1.2.2 病毒宏基因组学处理24
• 1.2.3 病毒宏基因组学测序24
• 1.2.4 病毒验证24-27
• 1.3 结果27-43
• 1.3.1 蝙蝠种类鉴定及样品采集信息27
• 1.3.2 病毒宏基因组学分析结果27-30
• 1.3.3 病毒序列分析及检测结果30-43
• 1.4 讨论43-49
• 第二章 新型蝙蝠病毒的鉴定49-79
• 2.1 材料49-50
• 2.1.1 蝙蝠样品49
• 2.1.2 试剂及耗材49
• 2.1.3 细胞系49-50
• 2.1.4 实验仪器50
• 2.1.5 生物信息学软件50
• 2.2 方法50-58
• 2.2.1 病毒核酸提取50
• 2.2.2 引物设计50-51
• 2.2.3 蝙蝠样品检测51
• 2.2.4 病毒全基因组扩增及测序51-58
• 2.2.5 病毒分离58
• 2.3 结果58-74
• 2.3.1 蝙蝠圆环病毒鉴定结果58-65
• 2.3.2 蝙蝠布尼亚病毒鉴定结果65-68
• 2.3.3 蝙蝠副粘病毒鉴定结果68-71
• 2.3.4 蝙蝠冠状病毒鉴定结果71-74
• 2.4 讨论74-79
• 结论79-81
• 参考文献81-91
• 附录91-97
• 个人简介97-99
• 致谢99-101

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