山羊溶酶体α-甘露糖苷酶D221位点的截短表达及其特性研究

发布时间：2017-09-23 06:37

  本文关键词：山羊溶酶体α-甘露糖苷酶D221位点的截短表达及其特性研究

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【摘要】：疯草是我国西部草场主要有毒植物且严重危害草地畜牧业,疯草中毒主要原因是其毒性成分苦马豆素(swainsonine,SW)能够抑制细胞中溶酶体α-甘露糖苷酶(lysosomal AMA,LAM)的活性,细胞内寡聚糖积聚,使细胞空泡化,甚至动物死亡。山羊溶酶体a-甘露糖苷酶(Capra hircas LAM,chLAM)的研究将有助于探明动物疯草中毒的机理,为防治动物疯草中毒提供资料。目前的研究表明,chLAM的活性中心由9个保守的氨基酸位点构成。依据chLAM的活性中心活性位点的氨基酸保守性程度不同,对基因chLAM进行包括和不包括D221位点的截短,chLAM-D222、chLAM-D220截短片段,以研究截短至D221位点对chLAM表达量及酶活性质的影响。结果如下:1.以chLAM基因序列为模板,设计chLAM、chLAM-D222、chLAM-D220特异性引物,获得正确目的基因片段;2.成功构建了酵母表达重组质粒pPIC9K-chLAM,pPIC9K-chLAM-D222和pPIC9K-chLAM-D220,线性化后电转入表达菌株GS115,甲醇终浓度0.6%诱导表达;重组蛋白进行酶活测定,分别为54.7 U、93.8 U、173.6 U,表达量为12.7μg/mg、32.4μg/mg、34.8μg/mg;3.重组蛋白纯化后,SDS-PAGE显示在约108 kDa(chLAM)、84 kDa(chLAM-D222、chLAM-D220)处有单一目的蛋白条带;4.纯化重组蛋白的WB检测,PVDF膜上可见108 kDa(chLAM)、84 kDa(chLAM-D222、chLAM-D220)处有单一抗原条带;5.重组蛋白chLAM、chLAM-D222、chLAM-D220的最适温度分别为55℃、35℃、35℃,最适pH分别为4.5、3.5、4.0;Zn~（2+）、Ca~（2+）对3种酶均有促进作用,Cu~（2+）、Co~（2+）对3种酶均有抑制作用;均对SW敏感,截短蛋白的活性不易被SW抑制。依据试验结果可知,通过对包括和不包括D221位点的截短提高了chLAM在毕赤酵母中的酶活及表达量,为酶活性中心位点的选择提供了理论依据。
【关键词】：溶酶体α-甘露糖苷酶 截短表达 毕赤酵母 特性研究
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.2
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-9
• 第一章 溶酶体 α-甘露糖苷酶及截短基因外源表达的研究进展9-17
• 1.1 不同物种 α-甘露糖苷酶的研究9-12
• 1.1.1 人溶酶体 α-甘露糖苷酶9-10
• 1.1.2 牛溶酶体 α-甘露糖苷酶10
• 1.1.3 羊溶酶体 α-甘露糖苷酶10-11
• 1.1.4 果蝇溶酶体 α-甘露糖苷酶11
• 1.1.5 酿脓链球菌 α-甘露糖苷酶11
• 1.1.6 α-甘露糖苷酶同源性比对11-12
• 1.2 截短基因外源表达的研究12-17
• 1.2.1 截短基因外源表达的意义12-15
• 1.2.2 截短位点的选择15-17
• 第二章 山羊溶酶体 α-甘露糖苷酶截短基因的克隆及鉴定17-21
• 2.1 材料17
• 2.1.1 主要仪器17
• 2.1.2 主要试剂17
• 2.1.3 培养基17
• 2.2 方法17-18
• 2.2.1 截短蛋白chLAM-D220的生物信息学分析17
• 2.2.2 截短基因的克隆及鉴定17-18
• 2.3 结果18-19
• 2.3.1 截短蛋白chLAM-D220的生物信息学分析18-19
• 2.3.2 截短基因的克隆及鉴定19
• 2.4 讨论19-20
• 2.4.1 截短蛋白生物信息学分析19-20
• 2.4.2 基因chLAM截短位点的选择20
• 2.5 小结20-21
• 第三章 chLAM截短蛋白的表达、纯化及其特性研究21-31
• 3.1 材料21-22
• 3.1.1 主要仪器21
• 3.1.2 主要试剂21
• 3.1.3 培养基21-22
• 3.2 方法22-25
• 3.2.1 克隆质粒的构建与鉴定22
• 3.2.2 表达质粒的构建与鉴定22
• 3.2.3 表达菌株GS115的构建与鉴定22-23
• 3.2.4 表达菌株GS115的筛选和鉴定23
• 3.2.5 表达菌株GS115的诱导表达23
• 3.2.6 酵母表达产物酶活性的测定23-24
• 3.2.7 重组蛋白的纯化及酶特性研究24-25
• 3.3 结果25-28
• 3.3.1 重组表达质粒的构建及鉴定25
• 3.3.2 重组酵母菌株基因组的PCR鉴定25
• 3.3.3 重组蛋白酶活性的测定25-26
• 3.3.4 重组蛋白的纯化26
• 3.3.5 重组蛋白的酶特性研究26-28
• 3.4 讨论28-30
• 3.4.1 截短对酶活及表达量的影响28-29
• 3.4.2 截短表达对酶反应温度、pH及金属离子的影响29
• 3.4.3 截短表达对SW抑制chLAM的影响29-30
• 3.5 小结30-31
• 结论31-32
• 参考文献32-38
• 致谢38-39
• 作者简介39

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本文编号：903818