白藜芦醇对小鼠精原干细胞生物学特性的影响

发布时间：2017-09-24 11:31

  本文关键词：白藜芦醇对小鼠精原干细胞生物学特性的影响

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【摘要】：精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)是位于雄性动物睾丸基底膜上由支持细胞等体细胞所构成的微环境中的一类干细胞。它具有干细胞的典型特征:自我更新和分化。在维持自身数量相对稳定的同时,通过精子发生源源不断地产生大量的精子。精原干细胞是成年雄性哺乳动物体内唯一传递遗传和表观信息的一类成体干细胞。随着年龄的不断增长,精原干细胞所处微环境稳态被破坏,结合其自身在受到氧化应激等损伤并不断积累,精原干细胞自我更新与分化功能逐渐衰退,睾丸中精原干细胞池日益枯竭,精子数量和质量也随之骤减,雄性动物生育力下降。白藜芦醇是一种多酚类植物抗毒素,可以模拟热量限制延长酵母、线虫及果蝇等生物的寿命。在小鼠食物中添加白藜芦醇时,可以通过激活SIRT1蛋白,有效缓解衰老导致的功能衰退,也可以抵抗高脂饮食对机体器官的损伤。白藜芦醇的作用具有组织和剂量特异性。它还可以作为化疗药物通过线粒体、p53或BCL2等途径诱导肝癌、胃癌、结肠癌等癌细胞的凋亡,抑制癌症的发生、发展和恶化。在尝试使用白藜芦醇缓解衰老对精原干细胞造成的损伤同时,应首先确定有效的工作浓度,探究白藜芦醇对精原干细胞是否有副作用及相关机制,避免二次损伤。白消安是骨髓移植前最常用的清髓药物,也是癌症治疗过程中化疗药物的一种。作为一种烷化剂,白消安主要通过引起细胞内ROS水平升高和DNA-DNA、DNA-蛋白、蛋白-蛋白交联等,破坏遗传物质稳定性,诱导凋亡发生。与衰老作用机制相似,白消安在临床应用过程中发现具有较强生殖毒性,并依此建立小鼠无精症模型,为精原干细胞移植和自我更新、分化以及衰老的研究奠定基础。本研究首先鉴定体外培养小鼠精原干细胞系C18-4的生物学特性,再检测不同浓度白藜芦醇对其细胞活力、增殖和凋亡水平的影响,并进一步经过线粒体膜电位、SIRT1-FOXO1信号通路和DNA完整性等实验探究各浓度白藜芦醇的作用机制,为初步探索白藜芦醇干预白消安引起的精原干细胞损伤实验提供参照。本试验为白藜芦醇对化疗或者衰老过程中雄性生育能力保护的研究奠定基础。1.白藜芦醇对小鼠精原干细胞系C18-4生物学特性的影响经过形态学和免疫荧光染色方法观察C18-4细胞呈圆形或椭圆形、核质比高,表达PLZF、NANOS2、VASA、SSEA1、CD49f,不表达STRA8等A型精原干细胞的典型特征。2μM白藜芦醇可促进C18-4细胞活力,但随着浓度升高,C18-4细胞活力逐渐下降。20μM将C18-4细胞增殖阻滞在S期,而当浓度升至200μM时,C18-4细胞核皱缩,细胞空泡化,增殖被抑制,凋亡率显著升高。2.初步探究不同浓度白藜芦醇对小鼠精原干细胞的作用机理线粒体膜电位检测表明2μM白藜芦醇可以保护线粒体完整性,促进能量代谢。而20μM和200μM剂量的白藜芦醇损伤线粒体功能。在200μM处理后DNA双链发生断裂,加剧C18-4细胞凋亡的发生。随着白藜芦醇浓度的升高,SIRT1蛋白表达量也逐渐增多,降低FOXO1的乙酰化修饰水平,且在小鼠精原干细胞内FOXO1蛋白从核、质分布逐渐集中到细胞核分布。凋亡相关蛋白p38表达量与白藜芦醇浓度正相关,而抗凋亡蛋白BCL2在2μM白藜芦醇刺激下表达量升高,200μM时BCL2表达受抑制,促进凋亡的发生。3.白藜芦醇促进小鼠无精症模型精原干细胞的恢复白消安腹腔注射4周后,小鼠睾丸中曲细精管精原干细胞位置呈空泡化,附睾中精子完全消失。当进行白藜芦醇干预时,可以促进精原干细胞的恢复,其中100 mg/kg/d剂量的白藜芦醇作用最明显,此时附睾中可以观察到精子存在。实时荧光定量PCR检测表明,白藜芦醇可以抑制凋亡相关基因p53、c-Myc和FoxO1的转录,而精原干细胞的标记基因Thy1、Plzf表达量相对升高,分化标记基因c-Kit和支持细胞标记基因Sox9表达量相对下降,增殖标记基因Pcna表达量上调。说明白藜芦醇可以通过抑制精原干细胞凋亡,促进增殖,从而增强其在白消安受损后的恢复能力。Western-Blotting检测显示白藜芦醇干预后SIRT1蛋白显著性上调,并去乙酰化下游FOXO1蛋白。
【关键词】：精原干细胞 白藜芦醇 凋亡 SIRT1 衰老
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S859.7
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 文献综述14-26
• 1.1 精原干细胞研究进展14-18
• 1.1.1 精原干细胞的定义与生物学特性15-16
• 1.1.2 精原干细胞自我更新机制的研究16-17
• 1.1.3 精原干细胞衰老的研究17-18
• 1.2 白藜芦醇的研究进展18-24
• 1.2.1 白藜芦醇的来源与理化性质19-20
• 1.2.2 白藜芦醇与衰老20-24
• 1.3 小结与展望24-26
• 第二章 不同浓度白藜芦醇对小鼠精原干细胞活力的影响26-38
• 2. 引言26
• 2.1 材料26-27
• 2.1.1 实验材料26
• 2.1.2 主要试剂26-27
• 2.1.3 主要仪器与耗材27
• 2.2 方法27-32
• 2.2.1 主要溶液的配制27-29
• 2.2.2 C18-4 细胞的复苏、传代培养与冻存29-30
• 2.2.3 贴壁细胞免疫荧光染色30
• 2.2.4 CCK-8 检测细胞活力30
• 2.2.5 Giemsa染色30
• 2.2.6 细胞凋亡率的测定30-31
• 2.2.7 BrdU染色31
• 2.2.8 细胞周期的测定31-32
• 2.3 结果32-36
• 2.3.1 C18-4 细胞的生物学特性32-33
• 2.3.2 不同浓度白藜芦醇对C18-4 细胞活力的影响33-34
• 2.3.4 不同浓度白藜芦醇对C18-4 凋亡水平的影响34-35
• 2.3.5 不同浓度白藜芦醇对C18-4 增殖周期的影响35-36
• 2.4 讨论36
• 2.5 小结36-38
• 第三章 不同浓度白藜芦醇对小鼠精原干细胞作用机理的研究38-47
• 3.1 材料38-39
• 3.1.1 实验材料38
• 3.1.2 主要试剂38-39
• 3.1.3 主要仪器与耗材39
• 3.2 方法39-40
• 3.2.1 线粒体膜电位检测39
• 3.2.2 Western-Blotting39-40
• 3.2.3 贴壁细胞免疫荧光染色40
• 3.3 结果40-45
• 3.3.1 白藜芦醇对小鼠精原干细胞线粒体膜电位的影响40-42
• 3.3.2 白藜芦醇影响小鼠精原干细胞内SIRT1蛋白的表达和定位42-43
• 3.3.3 白藜芦醇影响小鼠精原干细胞内FOXO1蛋白的表达和定位43-44
• 3.3.4 高浓度白藜芦醇引起小鼠精原干细胞DNA双链断裂44-45
• 3.3.5 不同浓度白藜芦醇处理后相关蛋白表达水平变化45
• 3.4 讨论45-46
• 3.5 小结46-47
• 第四章 白藜芦醇促进无精症模型小鼠精原干细胞的恢复47-54
• 4.1 材料47
• 4.1.1 实验材料47
• 4.1.2 主要试剂47
• 4.1.3 主要仪器与耗材47
• 4.2 方法47-49
• 4.2.1 主要溶液的配制47-48
• 4.2.2 白消安诱导无精症小鼠模型的构建48
• 4.2.3 白藜芦醇干预48
• 4.2.4 H&E染色48
• 4.2.5 荧光实时定量PCR48-49
• 4.2.6 Western-Blotting检测49
• 4.3 结果49-52
• 4.3.1 白藜芦醇可以促进白消安损伤后精原干细胞的恢复49-50
• 4.3.2 白藜芦醇对无精症小鼠中相关基因表达的影响50-52
• 4.3.3 白藜芦醇可以通过激活SIRT1促进精原干细胞的恢复52
• 4.4 讨论52-53
• 4.5 小结53-54
• 结论54
• 本文研究的创新点及进一步研究的课题54-55
• 参考文献55-68
• 致谢68-70
• 作者简介70

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