神经细胞内参与狂犬病病毒感染的胞内体类型研究

发布时间：2017-09-25 10:26

本文关键词：神经细胞内参与狂犬病病毒感染的胞内体类型研究

【摘要】：高度嗜神经性的狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)是弹状病毒科狂犬病病毒属成员,能够通过网格蛋白介导和p H依赖的内吞途径侵入神经细胞,经轴突运输到达胞体。虽有研究表明RABV P蛋白的相关区域可与动力蛋白轻链(LC8)直接结合介导RABV逆轴浆传输,但P蛋白上缺失此区域的重组RABV仍能在中枢神经系统(CNS)扩散。应用囊膜和衣壳双荧光标记揭示RABV以完整病毒粒子在胞内运输。由于胞内体系统是细胞内物质运输的基本方式,内吞入胞物质利用不同类型的胞内体被分选和定向运输到目的区域。Rabs是G蛋白超家族成员,是一类定位于不同类型胞内体的重要调控因子,其中Rab5和Rab7分别定位于早期、晚期胞内体,参与胞内体分选、成熟和定向运输。已有研究表明,多种有囊膜病毒如流感病毒(IV)、水泡性口炎病毒(VSV)以及腺病毒(ADV)等都可利用胞内体系统进行运输,且在不同程度上受到Rab5与Rab7的调控。然而,RABV感染神经细胞是否也依赖于胞内体系统,Rab5、Rab7是否参与调控RABV感染进程尚不清楚。为此,本研究制备了大鼠胚胎皮层原代神经元,利用免疫荧光分别标记早期胞内体标志蛋白Rab5、EEA1和晚期胞内体标志蛋白Rab7、LAMP1,初步筛选神经细胞中与RABV共定位的囊泡类型,对RABV感染的原代神经元制作电镜超薄切片,观察病毒粒子在神经细胞内的分布情况,借助免疫胶体金标记Rab5与Rab7,进一步确定RABV定位的囊泡类型;采用RNAi技术下调N2a和SH-SY5Y细胞内Rab5与Rab7的表达,通过免疫荧光、Western blot及TCID50等技术,检测RABV在细胞内的荧光强度、N蛋白表达水平和病毒滴度等;最后,构建RFP-Rab5与RFP-Rab7融合表达载体,利用电转染法导入原代神经细胞内,为RABV与胞内体双荧光活细胞示踪奠定基础。结果显示,RABV感染神经元后,分别与早期胞内体标志蛋白Rab5、EEA1及晚期胞内体标志蛋白Rab7、LAMP1出现典型的共定位,神经元超薄切片显示RABV存在于胞浆膜状细胞器内,免疫胶体金标记指示RABV所在囊泡膜上有Rab5和Rab7标志,印证了RABV感染需要早期和晚期胞内体参与。在N2a和SH-SY5Y细胞中RABV也与Rab5和Rab7发生了显著共定位,用si RNA下调Rab5与Rab7后,RABV感染初期病毒荧光强度、N蛋白表达量均显著下降,病毒TCID50也随之降低,表明RABV感染初期受到Rab5、Rab7的调控,并且Rab5下调后RABV主要滞留在细胞膜附近,Rab7下调后RABV弥散分布在胞浆内,提示Rab5主要参与RABV入胞后的分选,Rab7负责指导RABV向细胞核的定向运输,二者共同参与调控RABV感染;最后,我们构建出Rab5、Rab7的红色荧光蛋白融合表达质粒,利用电转染成功导入原代神经元并正常表达,为活细胞示踪,从动力学角度研究Rab5、Rab7对RABV逆轴浆转运的调控机制奠定了基础。通过本研究,得出以下结论:1.RABV感染需要早、晚期胞内体参与,初步确定了参与RABV感染的胞内体类型;2.RABV感染初期受到Rab5与Rab7的调控,二者对RABV入胞后的分选和定向运输发挥作用;3.应用电转染将标记蛋白发光质粒成功导入神经元,为后期活细胞内RABV逆轴浆示踪的动力学研究奠定了基础。
【关键词】：狂犬病病毒 胞内体系统 胞内体 神经元 Rab5 Rab7
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
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