顺铂诱导体外犬乳腺肿瘤细胞凋亡及相关凋亡因子研究

发布时间：2017-09-27 01:17

  本文关键词：顺铂诱导体外犬乳腺肿瘤细胞凋亡及相关凋亡因子研究

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【摘要】：犬乳腺肿瘤是目前兽医临床上常见的疾病之一,对该疾病的防治一直是宠物医生密切关注的问题。由于犬乳腺肿瘤的发生发展与人类乳腺肿瘤具有很多相似之处,又可将其作为人乳腺肿瘤的优良模型,来研究抗癌药物的开发。顺铂是治疗多种肿瘤的一线化疗药物,它的广谱抗癌作用一直受到人们的好评,临床上用于卵巢癌、前列腺癌、肺癌及成骨肉瘤等多种实力肿瘤均有很好的疗效。而顺铂在犬乳腺肿瘤方面的研究国内外文献较少,且顺铂诱导犬乳腺肿瘤的抗癌机制也未见报道。本实验探究顺铂诱导犬乳腺肿瘤细胞凋亡及其对相关凋亡因子影响,对今后犬乳腺肿瘤的临床治疗与方案制定有着重要意义,也为人乳腺肿瘤的研究提供理论依据。实验采用体外培养犬乳腺肿瘤细胞系CHMp(原发灶细胞)和CHMm(转移灶细胞)作为模型,经不同浓度顺铂2.5μmol/L,5.0μmol/L和10μmol/L处理后培养12h,24h和48h,用倒置显微镜观察和记录细胞增殖与生长形态,通过MTT法检测顺铂对CHMm/CHMp的IC50值与细胞毒性实验,同时用流式细胞仪检测分析CHMm/CHMp的凋亡变化与周期阻滞影响,最后采用荧光定量PCR和Western Blot分别检测CHMm/CHMp中凋亡相关因子AKT,,Bcl-2,NFκB的基因表达和蛋白表达。将实验数据导入SPSS19.0软件中统计分析得到实验结果。结果表明:(1)MTT法检测CHMm与CHMp的IC50值分别为4.86μmol/L和5.58μmol/L。且同一时间点对照组和药物处理组比较差异极显著(p0.01),而同一浓度下各实验组组间差异也极显著(p0.01),随着顺铂浓度的增加,作用时间的延长,两细胞系的抑制率逐渐上升,存在浓度-时间双重依赖性。(2)显微镜下观察CHMm与CHMp对照组细胞贴壁生长,轮廓清晰,界限明显;顺铂作用剂量为5μmol/L,肿瘤细胞状态实验组与对照组相比胞体偏大,胞质较透明,贴壁能力强;顺铂作用剂量为10μmol/L时,实验组细胞明显变圆,胞质浑浊,折光性差,在高倍镜下观察可看到黑色颗粒物增多。(3)流式细胞仪检测细胞凋亡显示,各实验组差异显著(p0.05),随顺铂浓度增加,CHMm/CHMp细胞团均上移,凋亡细胞逐渐增加,细胞的抑制率随之增加。检测细胞周期显示,CHMm/CHMp随着顺铂浓度的增加,G1期比率差异不显著(p0.05),S期比率显著上升(P0.01),G2期比率逐渐下降(p0.05)。表明顺铂同样能够抑制肿瘤细胞进行有丝分裂,阻滞细胞于S期。(4)荧光定量PCR检测凋亡因子基因表达显示,CHMm/CHMp对照组与各实验组差异极显著(p0.01),同一浓度顺铂作用下,各时间组组间差异显著(p0.05)。随着作用时间延长,对照组AKT、Nfκb和bcl-2基因表达均呈上升趋势,而实验组中随顺铂浓度增加,Bcl-2和AKT基因表达明显逐渐下降,Nfκb基因表达却显著增高。且CHMm与CHMp中AKT、NFκb和Bcl-2基因表达含量存在差异。(5)Western Blot检测凋亡因子蛋白表达证明,同一作用时间点24h时,Akt和bcl-2的蛋白表达含量随着顺铂浓度的增加而逐渐减少,Nfκb的蛋白含量随之逐渐增加。相同顺铂浓度为5μmol/L时,Akt和bcl-2的蛋白表达量随作用时间的延长而逐渐减少,Nfκb的蛋白含量随之逐渐增加。通过实验得出以下结论:顺铂对犬乳腺肿瘤细胞CHMm/CHMp均有抑制作用,且存在时间-浓度依赖性。CHMm的IC50为4.86μmol/L,CHMp的IC50为5.58μmol/L;显微镜下观察顺铂能够诱导犬乳腺肿瘤细胞CHMm/CHMp细胞凋亡;顺铂对CHMm/CHMp的S期有阻滞作用;CHMm和CHMp细胞内AKT、BCL-2和NFκB基因和蛋白表达都不同,顺铂能下调AKT、Bcl-2基因和蛋白表达,上调NFκB基因和蛋白表达。
【关键词】：犬乳腺肿瘤细胞 体外培养 细胞凋亡 凋亡相关因子
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.292
【目录】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 引言12-18
• 1.1 犬乳腺肿瘤及其研究进展12
• 1.2 肿瘤细胞的体外培养12-13
• 1.3 肿瘤细胞凋亡及研究进展13
• 1.4 细胞凋亡途径13-14
• 1.5 Akt、NF-kB、Bcl-2 与肿瘤的关系研究现状14-16
• 1.6 顺铂药物及研究发展16-17
• 1.7 研究目的和意义17-18
• 2 材料与方法18-27
• 2.1 材料18-21
• 2.1.1 细胞系18
• 2.1.2 主要仪器18
• 2.1.3 主要试剂18-19
• 2.1.4 主要试剂的配制19-21
• 2.2 实验方法21-27
• 2.2.1 犬乳腺肿瘤细胞的体外培养21
• 2.2.2 MTT法检测细胞活力21-22
• 2.2.3 不同浓度顺铂对犬乳腺肿瘤细胞凋亡检测22
• 2.2.4 不同浓度顺铂对犬乳腺肿瘤细胞周期检测22
• 2.2.5 荧光定量PCR检测凋亡相关因子22-24
• 2.2.6 Western Blot检测凋亡相关因子24-26
• 2.2.7 实验数据统计与分析26-27
• 3 实验结果27-43
• 3.1 顺铂对犬乳腺肿瘤细胞体外增值抑制检测27-30
• 3.1.1 MTT法犬乳腺肿瘤细胞IC50值检测27-28
• 3.1.2 MTT比色法检测顺铂对CHMm和CHMp肿瘤细胞活性影响28-30
• 3.2 顺铂诱导犬乳腺肿瘤细胞凋亡的检测30-37
• 3.2.1 犬乳腺肿瘤细胞CHMm形态学观察30-31
• 3.2.2 犬乳腺肿瘤细胞CHMp形态学观察31-32
• 3.2.3 顺铂作用后CHMm流式细胞凋亡检测32-33
• 3.2.4 顺铂作用后CHMp细胞流式细胞凋亡检测33-35
• 3.2.5 CHMm流式细胞周期检测35-36
• 3.2.6 CHMp流式细胞周期检测36-37
• 3.3 顺铂对犬乳腺肿瘤中Akt、Nfκb、bcl-2 基因表达影响37-41
• 3.3.1 顺铂对CHMm中Akt、Nfκb、bcl-2 基因表达影响37-39
• 3.3.2 顺铂对CHMp中Akt、Nfκb、bcl-2 基因表达影响39-41
• 3.4 顺铂作用后犬乳腺肿瘤中Akt、Nfκb、bcl-2 蛋白表达检测41-43
• 4 讨论43-48
• 4.1 顺铂对犬乳腺肿瘤细胞的细胞毒性作用43
• 4.2 顺铂对犬乳腺肿瘤细胞的形态影响43-44
• 4.3 顺铂对犬乳腺肿瘤细胞凋亡和周期的影响44-45
• 4.4 顺铂对乳腺肿瘤细胞凋亡相关因子的影响45-48
• 5 结论48-49
• 致谢49-50
• 参考文献50-56
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文56

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本文编号：926829