旋毛虫谷氨酸脱羧酶TsGAD的表达和定位及不同pH对其影响的研究

发布时间：2017-09-27 12:04

  本文关键词：旋毛虫谷氨酸脱羧酶TsGAD的表达和定位及不同pH对其影响的研究

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【摘要】：旋毛虫病是由旋毛形线虫(Trichinella spiralis)引起的一种危害严重的人兽共患线虫病。宿主通过摄入含有感染性肌幼虫的肉而致病,富含旋毛虫包囊的肉被哺乳动物吞食后,在胃酸的作用下,肌肉组织在胃内消化,感染性肌幼虫被释放出来。旋毛虫作为一种食源性病原体,其生活史决定了旋毛虫肌幼虫需经过哺乳动物的胃这一极酸性环境进而导致宿主发病,但其是否存在与大肠杆菌相似的抗酸机制,现尚未见报道。已有研究结果证实,谷氨酸在旋毛虫体内,尤其是肌幼虫含量很高,并且旋毛虫谷氨酸脱羧酶(GAD)基因序列已发表可查,所以我们推测旋毛虫肌幼虫中也可能具有类似的谷氨酸依赖型抗酸系统。本文根据GenBank上TsGAD的基因编码序列设计带有酶切位点的特异性引物,提取旋毛虫肌幼虫总RNA,采用RT-PCR方法得到c DNA后,以c DNA作为模板进行PCR扩增,然后将PCR产物与p MD18-T载体连接后转入克隆感受态DH5α,经过PCR和Hind III、Bam HⅠ双酶切、测序后,将鉴定正确的目的片段与表达载体pET-30a(+)连接后转入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用诱导剂IPTG诱导蛋白表达,通过对诱导表达条件的优化,采用1mol/L IPTG,于37°C诱导5h是表达效果最为理想的条件,经SDS-PAGE分析目的蛋白出现于57k Da左右,目的蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为57KDa,与预测的理论值相符。实验采用比色法测定TsGAD重组蛋白活性,结果显示TsGAD具有酶活性,活性大小为1.5U,说明通过复性得到正确折叠结构的Ts GAD蛋白。将纯化的重组蛋白多位点免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,获得免疫多抗血清,用Western Blot方法对免疫原性进行分析,结果显示,多克隆抗血清作为抗体可以识别重组蛋白并与之结合。利用间接ELISA方法检测获得的多抗效价,结果表明,获得的多抗效价达到1:65536,该重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,并且特异性高;免疫荧光定位试验结果证明,Ts GAD分布于旋毛虫肌幼虫虫体体表。根据Gen Bank中发表的旋毛虫的TsGAD和TsGAPDH基因序列,设计实时荧光引物,建立荧光定量PCR检测方法。利用建立的Ts GAD实时荧光PCR检测方法,将p H设置4个梯度,分别为p H 2.5、pH 4.0、pH 6.6和p H 9.0,为了检测不同p H条件下培养的旋毛虫肌幼虫Ts GAD m RNA的表达水平。研究结果显示,随着pH值的降低,Ts GAD mRNA表达量逐渐升高,在p H 2.5时Ts GAD mRNA表达量显著高于pH 4.0、p H 6.6和p H 9.0(p0.05);同样将培养时间设置3个梯度,分别是0.5h、1h和3h,此时Ts GAD的mRNA相对表达量也不同,培养1h的表达量高于培养0.5h和3h。研究结果表明,极酸环境能显著诱导Ts GAD mRNA的表达,我们推测Ts GAD在酸性条件下具有抗酸性,TsGAD可能参与旋毛虫与宿主之间的抗酸过程,这为进一步研究旋毛虫的谷氨酸依赖型抗酸机理提供依据,还为以后预防、治疗及诊断旋毛虫病奠定基础。
【关键词】：旋毛虫肌幼虫 谷氨酸脱羧酶(GAD) 原核表达 抗酸性 实时荧光定量PCR
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7
【目录】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 引言11-18
• 1.1 旋毛虫病及旋毛虫生活史11
• 1.2 谷氨酸脱羧酶概况11-13
• 1.2.1 GAD的来源及用途11-12
• 1.2.2 GAD的酶学性质12
• 1.2.3 GAD的分子生物学研究12-13
• 1.2.4 GAD酶活力的测定13
• 1.3 γ-氨基丁酸（GABA）13
• 1.3.1 GABA理化性质及应用13
• 1.3.2 GABA的制备13
• 1.4 常见胃肠道致病菌抗酸机制的研究进展13-17
• 1.4.1 大肠杆菌的抗酸机制14-15
• 1.4.2 沙门氏菌的抗酸机制15-16
• 1.4.3 志贺式杆菌的抗酸机制16
• 1.4.4 弧菌的抗酸机制16
• 1.4.5 乳酸乳球菌的抗酸机制16-17
• 1.4.6 单增李斯特菌的抗酸机制17
• 1.5 研究的目的和意义17-18
• 2 材料与方法18-29
• 2.1 材料18-19
• 2.1.1 虫株18
• 2.1.2 主要试剂18
• 2.1.3 主要仪器设备18-19
• 2.1.4 主要应用软件19
• 2.2 方法19-29
• 2.2.1 旋毛虫肌幼虫的收集19
• 2.2.2 引物设计与合成19
• 2.2.3 总RNA的提取19
• 2.2.4 逆转录19-20
• 2.2.5 TsGAD基因的克隆20-22
• 2.2.6 重组表达质粒的构建22-23
• 2.2.7 TsGAD重组蛋白的诱导表达23-24
• 2.2.8 比色法测定酶活性24
• 2.2.9 TsGAD蛋白的抗原性检测24-25
• 2.2.10 TsGAD蛋白荧光免疫定位25-26
• 2.2.11 pH对旋毛虫肌幼虫TsGAD mRNA表达水平的影响26-28
• 2.2.12 肌幼虫体外存活率的检测28-29
• 3 结果29-41
• 3.1 TsGAD基因克隆结果29
• 3.1.1 旋毛虫肌幼虫TsGAD扩增29
• 3.1.2 重组克隆质粒p MD18-T-Ts GAD的鉴定29
• 3.2 诱导表达结果29-32
• 3.2.1 重组质粒pET-30a-Ts GAD的鉴定29-30
• 3.2.2 重组蛋白表达时相及可溶性分析30-31
• 3.2.3 pET-30a-GAD重组蛋白诱导条件的优化31-32
• 3.3 TsGAD酶活性的检测32-33
• 3.4 多克隆抗体效价的测定33
• 3.5 重组蛋白Western Blot检测结果33-34
• 3.6 TsGAD蛋白荧光免疫定位34
• 3.7 不同pH对旋毛虫肌幼虫TsGAD mRNA表达水平的影响34-41
• 3.7.1 RT-TsGAD基因和内参RT-Ts GAPDH基因片段的扩增34
• 3.7.2 标准品的构建34-36
• 3.7.3 RT-TsGAD、RT-TsGAPDH荧光定量PCR检测方法的建立36-38
• 3.7.4 pH对TsGAD mRNA表达水平的影响38
• 3.7.5 培养时间对TsGAD mRNA表达水平的影响38
• 3.7.6 肌幼虫存活率的检测38-41
• 4 讨论41-44
• 4.1 TsGAD基因的原核表达41
• 4.2 TsGAD酶活性的测定及免疫相关性的分析41
• 4.3 不同pH对旋毛虫肌幼虫TsGAD mRNA表达水平的影响41-43
• 4.4 本实验的创新之处43-44
• 5 结论44-45
• 致谢45-46
• 参考文献46-51
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文51

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本文编号：929562