miR-126-3p调控猪卵巢颗粒细胞功能的研究

发布时间：2017-09-28 03:26

  本文关键词：miR-126-3p调控猪卵巢颗粒细胞功能的研究

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【摘要】：卵巢是哺乳动物重要的生殖腺,是卵泡发育和排卵的重要器官。卵泡是卵巢的结构和功能单位,原始卵泡的正常募集、激活以及生长卵泡的发育、排卵是保障母猪终身繁殖力的前提。卵泡的发育过程伴随着颗粒细胞生长、发育和分化,颗粒细胞的增殖和凋亡与卵泡发育卵母细胞的成长发育、原始卵泡生长的启动、生长期卵泡发育的调控以及卵泡闭锁密切相关。众多研究表明颗粒细胞相关基因和miRNA影响着颗粒细胞功能,进而影响卵泡生长发育。本课题组前期通过对青春期前和疑似卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)后备母猪卵巢组织进行了miRNA表达谱分析,获得了与卵泡发育相关的miRNAs,筛选了在疑似POF后备母猪卵巢高表达的miR-126-3p为候选miRNA。本研究运用Annexin V-FITC流式检测、Edu荧光显微镜检测、qRT-PCR和Western Blot等实验技术对miR-126-3p细胞生物学功能、靶基因生物学功能及其对颗粒细胞功能影响。研究结果对深入了解母猪卵巢颗粒细胞对卵泡发育分子机制奠定基础,对进一步了解卵巢卵泡发育的分子调控机制以及对畜牧生产的经济效益的提高具有重要意义。本研究结果具体如下:1.Annexin V-FITC流式检测结果表明,miR-126-3p能够抑制颗粒细胞凋亡。运用Edu荧光显微镜检测结果表明,miR-126-3p能够促进颗粒细胞增殖。2.生物信息学预测miR-126-3p靶向原始卵泡激活和休眠相关PI3K-AKT通路中的关键基因PIK3R2和TSC1。进一步通过双荧光报告基因验证该miRNA能够结合PIK3R2 3’UTR和TSC1 3’UTR抑制报告基因表达;qRT-PCR和Western blotting结果表明miR-126-3p能够在转录后水平负调控PIK3R2,在翻译水平负调控PIK3R2和TSC1的表达。3.Annexin V-FITC和Edu检测表明,抑制PIK3R2和TSC1后(转染siRNA-PIK3R2和siRNA-TSC1)能够抑制颗粒细胞凋亡,而促进颗粒细胞增殖。补充外源的siRNA-PIK3R2和siRNA-TSC1则能够减弱抑制miR-126-3p引起的促进颗粒细胞凋亡作用和回复抑制miR-126-3p引起的抑制颗粒细胞增殖作用。4.通过qRT-PCR检测转染siRNA-PIK3R2和siRNA-TSC1后所在PI3K通路上下游基因的表达变化。检测结果表明,转染siRNA-PIK3R2使得IGF1R、INRS、PDK1和AKT1表达量下降,而IRS1表达量上升;PTEN表达量变化不明显。转染siRNA-TSC1后使得PTEN、AKT1、TSC2、rpS6和mTOR表达量上升,而PDK1表达量变化不明显。上述结果揭示了miR-126-3p能够通过PIK3R2和TSC1抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡和促进颗粒细胞增殖,为深入了解miRNA调控卵巢卵泡发育提供借鉴,同时也为后续研究PIK3-AKT通路在卵巢颗粒细胞中的研究奠定基础。
【关键词】：猪 颗粒细胞 miR-126-3p PIK3R2 TSC1
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 1 前言9-15
• 1.1 哺乳动物卵巢结构与功能9-10
• 1.2 颗粒细胞对卵泡发育过程的调控研究10-12
• 1.3 miRNA调控卵巢功能的研究进展12-13
• 1.4 miR-126 调控卵巢功能的研究进展13-14
• 1.5 研究目的与意义14
• 1.6 技术路线14-15
• 2 材料与方法15-33
• 2.1 实验材料15-17
• 2.1.1 实验样品15
• 2.1.2 实验仪器设备15-16
• 2.1.3 主要试剂16-17
• 2.1.4 试剂配制17
• 2.2 实验方法17-33
• 2.2.1 总RNA的提取17-18
• 2.2.2 总RNA检测及反转录18-20
• 2.2.3 q RT-PCR检测20-22
• 2.2.4 猪卵巢颗粒细胞原代和传代培养22-23
• 2.2.5 猪卵巢颗粒细胞的接种和转染23-24
• 2.2.6 猪卵巢颗粒细胞凋亡检测24
• 2.2.7 猪卵巢颗粒细胞增殖检测24-25
• 2.2.8 靶基因PIK3R2、TSC1的预测25
• 2.2.9 构建靶基因双荧光素酶报告载体25-32
• 2.2.10 双荧光素酶报告系统检测32
• 2.2.11 Western Blot32-33
• 3 结果与分析33-50
• 3.1 miR1263p对猪卵巢颗粒细胞功能的影响33-36
• 3.1.1 miR1263p小片段效率检测33-34
• 3.1.2 miR1263p抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡34-35
• 3.1.3 miR1263p促进猪卵巢颗粒细胞增殖35-36
• 3.2 miR1263p靶基因的预测及验证36-43
• 3.2.1 靶基因生物信息学分析36-37
• 3.2.2 构建靶基因双荧光素酶报告载体、突变载体及缺失载体37-40
• 3.2.3 靶基因双荧光活性检测40-41
• 3.2.4 qRT-PCR检测miR1263p对靶基因转录水平的影响41-42
• 3.2.5 Western Blot检测miR1263p对靶基因蛋白水平的影响42-43
• 3.3 靶基因TSC1、PIK3R2对猪卵巢颗粒细胞功能的影响43-48
• 3.3.1 siPIK3R2、siTSC1干扰效率检测43-44
• 3.3.2 干扰PIK3R2、干扰TSC1抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡44-45
• 3.3.3 干扰PIK3R2、干扰TSC1促进猪卵巢颗粒细胞增殖45-46
• 3.3.4 干扰PIK3R2检测其通路上下游基因的表达46-47
• 3.3.5 干扰TSC1检测其通路上下游基因的表达47-48
• 3.4 miR1263p靶基因PIK3R2、TSC1功能回复验证48-50
• 3.4.1 靶基因PIK3R2、TSC1细胞凋亡回复验证48-49
• 3.4.2 靶基因PIK3R2、TSC1细胞增殖回复验证49-50
• 4 讨论与结论50-59
• 4.1 miRNA对猪卵巢颗粒细胞功能调控50-52
• 4.2 miRNA靶基因的预测与验证52-54
• 4.3 PIK3R2、TSC1在猪卵巢中的研究54-57
• 4.4 miR1263p靶基因PIK3R2、TSC1功能回复验证57
• 4.5 结论57-59
• 致谢59-60
• 参考文献60-67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：933572