日本血吸虫SjC1qBP基因的克隆表达及生物学功能研究

发布时间：2017-09-29 23:00

  本文关键词：日本血吸虫SjC1qBP基因的克隆表达及生物学功能研究

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【摘要】：血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病;目前,全球约有两亿人受到感染,八亿人面临着被感染的威胁。吡喹酮是血吸虫病治疗的首选药物,但其30多年的使用历史可能导致宿主产生耐药性,并且该药不能解决重复感染的问题。一直以来,研发血吸虫免疫预防疫苗是研究的热点方向之一,但研究进展相当缓慢,目前仍然缺乏有效的抗血吸虫病疫苗。处于机体防御第一线的补体系统是宿主杀伤血液内寄生虫的重要途径,可以迅速标记并清除入侵的病原微生物,介导体液免疫和细胞免疫,是机体中重要的免疫调控和效应级联放大系统;血吸虫在长期的进化过程中形成了非常成功的免疫逃避策略,一些血吸虫分子能够调节宿主的补体系统,这些分子对血吸虫在终末宿主体内的生存和发育起着极其重要的作用,是潜在的疫苗候选分子和理想的药物靶标。在日本血吸虫蛋白质组学研究中曾鉴定到C1q结合蛋白(C1qBP),推测其可能和日本血吸虫的补体抑制相关。本研究通过PCR扩增了日本血吸虫C1q结合蛋白(SjC1qBP)基因的开放阅读框,经生物信息学分析表明该基因ORF含729个核苷酸,编码242个氨基酸残基,既不存在跨膜区,也不存在信号肽,二级结构预测显示该基因编码的多肽以无规则卷曲为主,SMART软件分析该蛋白氨基酸序列结果显示其属于Pfam家族蛋白含有MAM33结构域,推测其具有补体C1q结合位点;RT-PCR分析表明SjC1qBP基因在日本血吸虫的各个发育阶段均可转录,其中在尾蚴中的转录水平相对较高,而在虫卵等其他阶段其转录水平大致相当;免疫组化实验结果显示SjC1qBP蛋白在虫卵中有分布、在日本血吸虫成虫中主要分布于体被。本研究构建了重组表达质粒pET-32a(+)-SjC1qBP,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达,并应用亲和层析方法纯化获得了包涵体重组蛋白,利用尿素浓度梯度透析得到了复性的重组蛋白分子rSjC1qBP;Western-blot检测结果表明rSjC1qBP具有良好的反应原性和免疫原性;动物免疫保护实验中,该重组蛋白诱导了有31.48%的减虫率以及45.12%的肝脏减卵率,同时重组蛋白rSjC1qBP分子经凝血酶酶切后获得的蛋白亚单位也诱导产生了显著的免疫保护效果;对该重组蛋白分子诱导小鼠产生的免疫应答分析表明,重组蛋白分子rSjC1qBP在首次免疫后就产生了较高水平的特异性抗体IgG,且抗体水平随免疫次数的增加而不断升高,到小鼠感染42d剖杀前抗体水平仍维持高水平。绵羊红细胞溶血抑制实验的检测结果表明,重组蛋白分子rSjC1qBP抑制补体溶血的现象非常明显,并且随着重组蛋白rSjC1qBP分子浓度的增加抑制作用越明显,在浓度达到1.5mg/mL时,溶血反应抑制率大于80%。在补体分子结合实验中,重组蛋白分子rSjC1qBP能特异地与C1q蛋白结合,表明日本血吸虫重组蛋白分子rSjC1qBP能够竞争性结合C1q,从而抑制补体经典途径。本研究结果表明,日本血吸虫SjC1qBP能通过结合补体C1q而抑制宿主补体溶血,该分子还具有血吸虫疫苗候选抗原分子的潜力,结果不仅拓展了对SjC1qBP基因功能的认识,为深入探究C1qBP的生物学功能奠定了坚实的基础,还为阐述日本血吸虫的免疫逃避机制提供了有价值的信息。
【关键词】：日本血吸虫 SjC1qBP基因 免疫保护效果 补体 免疫逃避
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.735
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文缩略表12-13
• 第一章 文献综述13-23
• 1.1 引言13-16
• 1.2 血吸虫的免疫逃避16-19
• 1.2.1 体被的隔离16-17
• 1.2.2 抗原变异17-18
• 1.2.3 分子模拟或伪装18
• 1.2.4 调节宿主的免疫应答18
• 1.2.5 小结18-19
• 1.3 血吸虫与补体系统19-23
• 1.3.1 经典途径（classical pathway）19-20
• 1.3.2 替代途径（alternative pathway）和MBL途径20-21
• 1.3.3 小结21-23
• 第二章 日本血吸虫SjC1qBP基因的克隆及其表达特性分析23-40
• 2.1 引言23-24
• 2.2 实验材料24-25
• 2.2.1 生物材料24
• 2.2.2 主要仪器24
• 2.2.3 酶和试剂24
• 2.2.4 试剂配制24-25
• 2.3 实验方法25-30
• 2.3.1 日本血吸虫SjC1qBP基因的克隆25-28
• 2.3.2 日本血吸虫SjC1qBP基因的生物信息学分析28
• 2.3.3 荧光RT-PCR分析C1qBP在日本血吸虫不同时期和性别中的转录水平28-29
• 2.3.4 SjC1qBP在日本血吸虫中的组织定位29-30
• 2.4 实验结果30-38
• 2.4.1 日本血吸虫SjC1qBP基因克隆30-32
• 2.4.2 日本血吸虫SjC1qBP生物信息学分析32-35
• 2.4.3 RT-PCR分析日本血吸虫SjC1qBP在不同期别虫体中的转录水平差异35-37
• 2.4.4 日本血吸虫SjC1qBP蛋白的组织定位37-38
• 2.5 讨论38-40
• 第三章 日本血吸虫SjC1qBP的表达纯化及其免疫分析40-55
• 3.1 引言40
• 3.2 实验材料40-43
• 3.2.1 生物材料40
• 3.2.2 主要仪器40-41
• 3.2.3 酶和试剂41
• 3.2.4 试剂配制41-43
• 3.3 实验方法43-48
• 3.3.1 日本血吸虫SjC1qBP基因的表达与纯化43-47
• 3.3.2 重组蛋白rSjC1qBP的抗原性检测47
• 3.3.3 重组蛋白rSjC1qBP的动物保护实验47-48
• 3.3.4 特异性抗体水平的检测48
• 3.4 实验结果48-53
• 3.4.1 日本血吸虫SjC1qBP基因表达与纯化48-51
• 3.4.2 重组蛋白rSjC1qBP抗原性检测51-52
• 3.4.3 重组蛋白rSjC1qBP动物保护实验52-53
• 3.4.4 特异性抗体水平检测53
• 3.5 讨论53-55
• 第四章 日本血吸虫SjC1qBP功能的初步探究55-61
• 4.1 引言55-56
• 4.2 实验材料56
• 4.2.1 主要仪器56
• 4.2.2 酶和试剂56
• 4.2.3 试剂配制56
• 4.3 实验方法56-57
• 4.3.1 重组蛋白分子rSjC1qBP的溶血实验56-57
• 4.3.2 重组蛋白rSjC1qBP与补体C1q的结合实验57
• 4.4 实验结果57-59
• 4.4.1 重组蛋白分子rSjC1qBP抑制补体溶血活性57-59
• 4.4.2 重组蛋白rSjC1qBP与补体C1q结合实验59
• 4.5 讨论59-61
• 第五章 全文总结61-62
• 参考文献62-67
• 致谢67-68
• 作者简历68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：944687