新城疫病毒HN蛋白的可溶性超表达与免疫活性检测

发布时间：2017-09-30 13:12

  本文关键词：新城疫病毒HN蛋白的可溶性超表达与免疫活性检测

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【摘要】：新城疫(Newcastle disease,ND)被称为亚洲鸡瘟或者伪鸡瘟。是由新城疫病毒(NDV)引起的急性高度接触性传染病。目前,新城疫在我国仍然十分流行,给我国的养禽业带来了巨大的经济损失,严重威胁我国养禽业的发展,故新城疫的防治十分重要。在我国主要以疫苗接种来防控该病的蔓延,使用传统疫苗可以预防新城疫,但与传统疫苗相比,将NDV基因组中一个或多个保护性抗原在原核或真核细胞中表达从而制备成亚单位疫苗更具有安全性能高、稳定性好、易于批量生产及生产成本低等优点。ND亚单位疫苗的制备主要以病毒囊膜表面的致病性糖蛋白为主。近年来新城疫亚单位疫苗的研究热点仍以HN蛋白为主,它与病毒的致病性和免疫原性密切相关,是决定病毒毒力的重要因素。而大量制备HN蛋白主要以大肠杆菌表达系统为主,大肠杆菌作为外源蛋白表达系统具有培养所需碳源价格便宜、细胞生长迅速和易于规模化培养等优点。然而,目前在大肠杆菌中高效表达可溶性外源蛋白还比较困难。有研究表明,在大肠杆菌表达系统中,采用融合标签与目的基因一起进行融合表达可以提高目的蛋白的可溶性表达量,然而,目前没有一个标签可以促进所有目的蛋白的可溶性表达。本试验采用融合表达的方法将人工合成的HN-SF基因分别与Grifin、GST、MBP、NusA、SUMO、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB这10种融合标签基因采用柔性接头进行连接,构建10个重组表达载体,经菌液PCR鉴定、双酶切鉴定及测序正确后,将这10个重组表达载体分别转入大肠杆菌BL21中,用不同条件进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,并用生物软件ImageJ分析并选出最佳诱导蛋白表达的条件,筛选出能够显著促进重组HN蛋白可溶性表达的标签。为了消除标签自身大小对表达量的影响,采用Western blot对所表达蛋白的含量进行定量分析。同时检测纯化的重组HN蛋白能否形成衣壳样纳米颗粒,用透射式电子显微镜观察其形态结构,纯化的重组HN蛋白用免疫印迹和间接ELISA检测其免疫活性。结果表明,成功将合成的HN-SF基因连接到带有标签的10个表达载体上,经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确,表明成功构建含有6×His-Grifin-TEV-HN-SF、6×His-GST-TEV-HN-SF、6×His-MBP-TEV-HN-SF、6×His-Nus A-TEV-HN-SF、6×His-SUMO-TEV-HN-SF、6×His-Thioredoxin-TEV-HN-SF、6×His-Protein G-TEV-HN-SF、6×His-γ-crystallin-TEV-HN-SF、6×His-Ars C-TEV-HN-SF、6×His-Ppi B-TEV-HN-SF的10个表达载体。用不同的条件进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测并用生物软件选出最佳诱导重组HN蛋白表达的条件为:诱导温度为16℃、IPTG的浓度为0.4 mmol/L、Amp的浓度为200μg/mL和LB液体培养基培养。在最佳诱导条件下显示:10个重组表达载体中只有N-端连接ProteinG标签没有检测到目的蛋白的表达,其余9个重组载体都有目的蛋白的表达。用Image J软件对可溶性表达量进行定量分析表明,pET3-HN可溶性表达量最高(62.7%),其次分别为p ET 2-HN(42.2%)、pET 5-HN(40.8%)、pET 6-HN(40.4%)、pET1-HN(39.5%)、pET7-HN(36.0%)、pET10-HN(27.3%)、pET 9-HN(26.8%)、pET 4-HN(5.2%)。筛选出融合标签MBP能够有效促进HN蛋白可溶性表达。为了消除标签自身大小对表达量的影响,选出可溶性表达量最高的两组(GST组和MBP组),用抗His标签的抗体对其可溶性表达量进行定量分析,Western blot结果表明最佳融合标签是MBP标签。随后对重组HN蛋白进行纯化,SDS-PAGE分析无其它杂带,表明纯化的蛋白纯度高,用超滤管浓缩纯化产物,其浓度达到1.6 mg/m L;在透射电子显微镜下观察重组HN蛋白能组装成衣壳样纳米颗粒的结构,经Western blot和间接ELISA检测分析表明截短表达的重组HN蛋白主要抗原区域具有良好的反应性与特异性,显示出良好的应用前景。融合标签MBP能显著提高HN蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量,为解决HN蛋白不可溶性表达和可溶性表达量低这一难题提供了新的方法和思路,同时为研究NDV的作用机制、有效疫苗的研制及诊断试剂的研制和开发奠定了基础,且对病毒性疾病的防治提供了参考依据。
【关键词】：新城疫 血凝素-神经氨酸酶 柔性接头 可溶性超表达 融合标签 疫苗 诊断试剂
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 致谢4-8
• 摘要8-10
• 常用缩略词10-11
• 1 文献综述11-24
• 1.1 新城疫病毒的概述11-14
• 1.1.1 NDV形态特征与理化特性11
• 1.1.2 基因组特性11-12
• 1.1.3 NDV的致病性12-13
• 1.1.4 ND的流行病学13-14
• 1.2 新城疫检测方法的研究14-16
• 1.2.1 临床症状和病理变化检测14
• 1.2.2 血清学诊断14-15
• 1.2.3 分子生物学诊断15-16
• 1.3 HN蛋白的研究进展16-19
• 1.3.1 HN蛋白的结构16-17
• 1.3.2 HN蛋白的功能17-18
• 1.3.3 HN蛋白的应用18-19
• 1.4 融合标签19-24
• 1.4.1 融合标签技术19-20
• 1.4.2 融合标签的特点20-21
• 1.4.3 载体上的标签21-24
• 1.4.3.1 His标签21
• 1.4.3.2 Grifin标签21
• 1.4.3.3 GST标签21
• 1.4.3.4 MBP标签21-22
• 1.4.3.5 NusA标签22
• 1.4.3.6 SUMO标签22-23
• 1.4.3.7 Thioredoxin标签23
• 1.4.3.8 proteinG标签23
• 1.4.3.9 γ-crystallin标签23
• 1.4.3.10 ArsC标签23
• 1.4.3.11 PpiB标签23-24
• 2 材料24-28
• 2.1 质粒和菌株24
• 2.2 实验动物24
• 2.3 主要仪器24
• 2.4 主要试剂24
• 2.5 常规溶液的配制24-28
• 3 方法28-35
• 3.1 目的基因和引物的合成28
• 3.2 重组表达载体的构建28-31
• 3.2.1 标签载体的构建28-29
• 3.2.2 大肠杆菌DH5α和BL21感受态细胞的制备（CaCl_2法）29-30
• 3.2.3 重组质粒的转化30
• 3.2.4 重组表达载体的构建30-31
• 3.3 重组质粒的鉴定31-32
• 3.3.1 菌液PCR鉴定31
• 3.3.2 双酶切鉴定31-32
• 3.4 序列测定32
• 3.5 重组HN蛋白诱导条件的优化32-33
• 3.5.1 最佳IPTG诱导浓度的确定32
• 3.5.2 最佳诱导温度的确定32
• 3.5.3 最佳Amp浓度的确定32
• 3.5.4 最佳诱导时间的确定32-33
• 3.5.5 最佳培养基的确定33
• 3.6 重组HN蛋白表达量的鉴定33-34
• 3.7 重组HN蛋白的纯化34
• 3.8 重组HN蛋白形态学分析34
• 3.9 重组HN蛋白的免疫活性检测34-35
• 3.9.1 Western blot检测34-35
• 3.9.2 间接ELISA检测35
• 4 结果与分析35-41
• 4.1 重组表达载体的构建35-36
• 4.1.1 标签质粒和pET 21b的双酶35-36
• 4.1.2 目的基因与pET的双酶切36
• 4.2 重组质粒的鉴定36-37
• 4.2.1 菌液PCR鉴定36
• 4.2.2 双酶切鉴定36-37
• 4.3 重组HN蛋白诱导条件的优化37-38
• 4.4 重组HN蛋白表达量的鉴定38-39
• 4.5 重组HN蛋白的纯化39
• 4.6 重组HN蛋白形态学分析39-40
• 4.7 重组HN蛋白免疫活性检测40-41
• 4.7.1 Western blot检测40
• 4.7.2 间接ELISA检测40-41
• 5 讨论41-42
• 全文总结42-43
• 参考文献43-52
• Abstract52-54

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本文编号：948369