结核分枝杆菌孤儿反应调节因子Rv0818基因缺失株的构建及功能的初步研究

发布时间：2017-10-01 22:35

  本文关键词：结核分枝杆菌孤儿反应调节因子Rv0818基因缺失株的构建及功能的初步研究

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【摘要】：结核分枝杆菌在巨噬细胞中生存需要面对多种极端的环境,如缺氧、一氧化氮杀伤、营养缺乏等等。双组份调节系统对于结核分杆菌在这些极端环境中存活至关重要。目前对于双组份调控系统孤儿反应调节因子Rv0818的功能及上游信号研究较少。本实验利用温敏性噬菌体介导的结核分枝杆菌敲除方法构建了Rv0818单基因缺失株。通过比较缺失株与野生株在固体平板上形态学特征、对于一氧化氮的耐受以及在巨噬细胞中的存活情况,观察Rv0818缺失对结核分枝杆菌的影响。并通过检测Rv0818下游基因表达量变化,验证了Rv0818作为转录调控因子的作用。本实验为结核病致病机理的研究提供了实验基础,同时给结核疫苗的研制提供了备选的基因缺失菌株。1结核分枝杆菌基因缺失株的构建与鉴定实验成功将Rv0818同源重组区域插入到分枝杆菌噬菌体中,并利用噬菌体感染结核分枝杆菌得到了能在Hyg抗性平板上生长的阳性克隆子。通过PCR鉴定和测序鉴定确定了目的基因被抗性区域替换,成功构建了结核分枝杆菌基因缺失株。2形态学特性比较实验比较了野生株与突变株在固体平板上的形态学特征。结果显示缺失株在固体平板上生长形成更少的索状结构,而索状结构的形成与菌株的个体大小、生长速率以及细胞壁外层结构密切相关,预示着Rv0818缺失株毒力的减弱。3 NO耐受能力的比较实验比较了野生株和缺失株在NO刺激条件下的生长情况。结果显示野生株与缺失株的生长会受到高浓度NO的抑制。而野生株能够更快从NO抑制作用中恢复,说明Rv0818的缺失影响了菌株对环境的适应能力。4胞内存活能力的比较实验比较了巨噬细胞对野生株与突变株的吞噬率,结果显示缺失株更容易被巨噬细胞吞噬。实验还比较了菌株在感染细胞后24h、48h、72h的存活情况。结果显示缺失株在胞内活菌数基本不变,而野生株活菌数在感染72h时增加了3倍,说明Rv0818的缺失使菌株在胞内的存活能力下降。5 Rv0818下游基因表达量变化实验比较了Rv0818缺失时部分基因表达量的变化。结果显示Rv0818缺失后,NO耐受相关基因的表达量显著上升,同时代谢相关基因表达量显著下调,验证了Rv0818对这些基因的调节作用。6兔抗Rv0818多克隆抗体的制备实验制备了兔抗Rv0818多克隆抗体,并通过Western Blot验证了其使用效果,结果显示该抗体可以用于Rv0818后续功能的研究。
【关键词】：结核分枝杆菌 孤儿反应调节因子 Rv0818 GlnR 基因缺失 NO耐受
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.618
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 缩略表9-10
• 1 前言10-17
• 1.1 结核病现状10-11
• 1.2 结核分枝杆菌生物学特性11
• 1.3 结核疫苗现状11-12
• 1.4 结核分枝杆菌免疫逃逸机制12-13
• 1.5 双组份调控系统13-14
• 1.6 孤儿反应调节因子Rv081814-17
• 2 研究目的与意义17-18
• 3 材料与方法18-36
• 3.1 材料18-22
• 3.1.1 菌株、细胞及载体18
• 3.1.2 工具酶及主要试剂18-19
• 3.1.3 培养基及抗生素19
• 3.1.4 溶液及缓冲液19-21
• 3.1.5 引物21-22
• 3.1.6 主要仪器22
• 3.2 方法22-36
• 3.2.1 结核分枝杆菌的培养与传代22-23
• 3.2.2 结核分枝杆菌全基因组的提取23
• 3.2.3 重组p0004s的构建23-27
• 3.2.4 重组ph AE159的构建27-28
• 3.2.5 重组分枝杆菌噬菌体的诱导28-29
• 3.2.6 基因缺失株的构建与鉴定29-30
• 3.2.7 结核分枝杆菌Rv0818多克隆抗体的制备30-32
• 3.2.8 Rv0818缺失株表型实验32-36
• 4 结果与分析36-46
• 4.1 结核分枝杆菌缺失株的构建36-40
• 4.1.1 重组p0004s的构建36-37
• 4.1.2 重组ph AE159的构建37-38
• 4.1.3 重组噬菌体PCR鉴定38-39
• 4.1.4 基因缺失株PCR鉴定39-40
• 4.2 兔抗Rv0818多克隆抗体的制备40-42
• 4.2.1 Rv0818原核表达菌株的鉴定40
• 4.2.2 Rv0818-his蛋白的纯化40-41
• 4.2.3 兔抗Rv0818多克隆抗体检测41-42
• 4.3 Rv0818缺失株表型实验42-46
• 4.3.1 菌落形态学观察42
• 4.3.2 NO杀伤实验42-44
• 4.3.3 胞内存活实验44-45
• 4.3.4 荧光定量PCR45-46
• 5 讨论46-49
• 5.1 结核分枝杆菌基因缺失平台的构建46
• 5.2 Rv0818多克隆抗体的制备46-47
• 5.3 缺失株表型实验47-49
• 6 结论49-50
• 参考文献50-58
• 致谢58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 刘二勇;周林;成诗明;;结核分枝杆菌潜伏性感染及预防性治疗研究进展的系统评价[J];中国防痨杂志;2013年04期

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本文编号：956089