CD163和Sn受体胞外区功能结构域在PRRSV-ADE中的作用

发布时间：2017-10-02 04:26

  本文关键词：CD163和Sn受体胞外区功能结构域在PRRSV-ADE中的作用

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【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征疫病是我国重要的传染病,猪繁殖与呼吸综合征病毒是该病的致病病毒。该病毒感染后不仅造成猪只的免疫抑制现象,还能够引发猪只的持续性感染。有研究表明FcγR介导的PRRSV-抗体感染性复合物感染巨噬细胞是引起PRRSV持续性感染的原因之一,然而该作用机制并不十分完善。我们的研究发现PRRSV-抗体感染性复合物感染巨噬细胞的过程可能和病毒受体也有关。通过研究CD163分子和Sn受体在PRRSV感染中的ADE作用,为进一步完善抗体介导的PRRSV持续感染机制,对PRRS新型疫苗的研制具有重要的指导意义。但是当前关于CD163分子和Sn受体在PRRSV入侵PAM细胞整个过程当中的分子机制以及PRRSV感染过程中ADE机制不是非常了解,PRRSV或者是PRRSV-抗体感染性复合物感染机体的过程也不清楚,也不确定CD163分子和Sn受体功能结构域发挥作用的具体位置。本试验将CD163分子胞外区的九个结构域分为四个片段,即CD163-P1(SRCR1-2),CD163-P2(SRCR3-4),CD163-P3(SRCR5-6)和CD163-P4(SRCR7-9),将Sn受体胞外区的17个结构域分为9个片段,即Sn1(1~150aa),Sn2(137~228aa),Sn3(236~406aa),Sn4(413~594aa),Sn5(599~791aa),Sn6(796~979aa),Sn7(981~1150aa),Sn8(1170~1248aa),Sn9(1441~1631aa)。用已构建好的CD163分子和Sn受体不同片段的结构域重组质粒转化进入表达菌BL21(DE3)中进行原核表达,并用不同浓度的尿素对表达的重组蛋白进行纯化。收集PAM细胞,铺于细胞培养板中,使PAM细胞贴壁,然后用CD163和Sn不同片段的不同稀释度的结构域重组蛋白与等体积的PRRSV或4倍稀释的PRRSV-IgG感染性复合物混合作用1h后,再感染PAM细胞,并设置阴性对照组,实时定量PCR方法检测PRRSV拷贝数,Graph Pad Prism 5软件对所得到的数据进行处理。本研究首先从PRRSV抗原抗体检测阴性猪的肺脏中收集PAM细胞,提取细胞总RNA,根据Sn(Gen Bank:JX070181.1)的基因序列及对Sn胞外区片段的划分,分别设计一对包含Sn6片段和Sn8片段结构域的特异性引物,再用RT-PCR方法扩增出Sn6和Sn8两个片段结构域基因,长度分别为735 bp和567 bp,并将含有结构域基因的这两个片段亚克隆到载体PET-32a质粒中,成功得到重组表达载体质粒PET-Sn6、PET-Sn8。将构建好的PET-Sn6和PET-Sn8重组质粒和实验室已经保存的PET-CD163-P1,PET-CD163-P2,PET-CD163-P3,PET-CD163-P4,PET-Sn1,PET-Sn2,PET-Sn3,PET-Sn4,PET-Sn5,PET-Sn7和PET-Sn9重组质粒转化到表达菌BL21(DE3)中,通过最佳IPTG诱导表达的时间和最适诱导表达的浓度,大量表达CD163-P1,CD163-P2,CD163-P3和CD163-P4,Sn1,Sn2,Sn3,Sn4,Sn5,Sn6,Sn7,Sn8和Sn9重组蛋白,并用不同浓度的尿素洗涤纯化重组蛋白,然后用紫外分光光度计测定蛋白浓度。为了探索CD163和Sn受体功能结构域在PRRSV感染PAM过程中发挥什么样的作用,将试验一所制备的CD163-P1,CD163-P2,CD163-P3和CD163-P4,Sn1,Sn2,Sn3,Sn4,Sn5,Sn6,Sn7,Sn8和Sn9结构域重组蛋白,分别用不加血清的1640营养液稀释为2.0mg/m L,1.0mg/m L,0.2mg/m L三个不同的浓度,再分别与等体积的200个TCID50/0.1m L PRRSV病毒充分混匀后放置于37℃培养箱作用1h,再感染PAM细胞孵育1h后,补加营养液作用48h,同时设置阴性对照组,用已建立的绝对荧光定量PCR方法检测感染细胞中PRRSV的拷贝数,并用Graph Pad Prism 5软件对所得到的数据进行处理。由试验结果可以看出,与PRRSV单纯感染PAM细胞组相比,CD163和Sn各片段不同稀释度的结构域重组蛋白与PRRSV混合作用感染48h后,PRRSV的拷贝数均明显低于对照组PRRSV的拷贝数,说明CD163和Sn各片段不同稀释度的结构域重组蛋白与PAM细胞上的CD163和Sn受体存在竞争与PRRSV结合的作用,并且重组蛋白浓度越高,竞争抑制作用越明显。在CD163各片段不同稀释度的结构域蛋白中,2.0mg/m L浓度的各片段蛋白中CD163-P1的抑制作用较明显,1.0mg/m L浓度的各片段蛋白中CD163-P3的抑制作用较明显,0.2mg/m L浓度的各片段蛋白中CD163-P2和CD163-P4的抑制作用较明显,但各个浓度总体之间的规律不太明显。在Sn各片段不同稀释度的结构域蛋白中,Sn6和Sn8片段各个浓度的结构域重组蛋白的竞争抑制作用相比其它片段更明显,表明Sn6和Sn8片段结构域可能在参与PRRSV感染PAM细胞中发挥主要作用,本试验为进一步研究CD163分子和Sn受体胞外区功能结构域在PRRSV感染PAM细胞的分子机制及PRRSV-ADE作用机制提供了一些参考依据。在此基础上,取2倍稀释的猪PRRSV特异性IgG 0.05m L与等体积的200个TCID50/0.1m L PRRSV(使用之前先用无血清的1640营养液稀释2.5倍)病毒充分混匀后,再取试验一所制备的CD163-P1,CD163-P2,CD163-P3和CD163-P4,Sn1,Sn2,Sn3,Sn4,Sn5,Sn6,Sn7,Sn8和Sn9结构域重组蛋白,并分别用不加血清的1640营养液稀释为2.0mg/m L,1.0mg/m L,0.2mg/m L三个不同的浓度,然后分别取各个不同浓度的重组蛋白0.1m L,充分混匀后放置于37℃培养箱作用1h,再感染PAM细胞孵育1h后,补加营养液作用48h,同时设置阴性对照组,用已建立的绝对荧光定量PCR方法检测感染细胞中PRRSV的拷贝数,并用Graph Pad Prism 5软件对所得到的数据进行处理。由试验结果可以看出,与单纯PRRSV-IgG感染PAM细胞对照组相比,高浓度的CD163各片段的结构域重组蛋白与PAM细胞上的CD163受体存在竞争与PRRSV结合的作用,在PRRSV-IgG感染PAM细胞的过程中抑制PRRSV的增殖,且浓度越高抑制作用越明显;而低浓度的CD163各片段的结构域重组蛋白与PRRSV-IgG作用一段时间后感染PAM细胞,发现PRRSV的拷贝数显著升高,结果表明CD163-P1,CD163-P2,CD163-P3和CD163-P4各片段结构域在PRRSV感染中的ADE作用规律并不明显。与单纯PRRSV-IgG感染PAM细胞对照组相比,高浓度的Sn各片段结构域蛋白对PRRSV-IgG侵入PAM后的增殖具有显著的抑制作用,且浓度越高抑制作用越明显;而低浓度的Sn各片段结构域蛋白中,Sn6和Sn8结构域蛋白与PRRSV-IgG混合作用一段时间后,PRRSV的增殖被抑制,而其他蛋白作用的PRRSV拷贝数有所上升,间接说明了Sn6和Sn8片段结构域参与了PRRSV感染的ADE作用,且Sn6和Sn8片段结构域同时作用时的ADE作用较明显。表明Sn6和Sn8片段结构域能够影响PRRSV-IgG在细胞内的复制增殖,暗示Sn6和Sn8片段结构域可能参与免疫复合物在细胞内的增殖,而且发挥主要功能作用。本研究进一步探讨了CD163分子和Sn受体胞外区功能结构域在PRRSV感染中的抗体依赖性增强作用,为深入研究PRRSV-抗体感染性复合物入侵宿主细胞的分子机制提供了理论依据,对PRRS新型疫苗的研制及抗病毒药物的筛选具有重要的指导意义。
【关键词】：PRRSV 重组蛋白 PRRSV-IgG CD163 Sn 抗体依赖性增强作用
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 致谢4-6
• 中文摘要6-9
• 英文缩略词9-10
• 文献综述10-23
• 引言23-24
• 试验一 CD163和Sn胞外区功能结构域重组蛋白的制备24-36
• 1. 材料24-25
• 2. 方法25-31
• 3. 结果与分析31-35
• 4. 讨论35-36
• 试验二 CD163和Sn受体胞外区功能结构域在PRRSV感染PAM细胞中的作用36-43
• 1. 材料36-37
• 2. 方法37-38
• 3. 结果与分析38-42
• 4. 讨论42-43
• 试验三 CD163和Sn受体胞外区功能结构域在PRRSV-ADE感染中的作用43-51
• 1. 材料43-44
• 2. 方法44-45
• 3. 结果与分析45-49
• 4. 讨论49-51
• 全文总结51-52
• 参考文献52-60
• 发表文章60-61
• ABSTRACT61-64

【参考文献】

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1 段二珍;周永辉;张宜娜;张继希;张志远;卢晓艳;刘肖萍;夏平安;崔保安;;FcγRⅡB介导的PRRSV感染的抗体依赖性增强作用[J];中国兽医学报;2012年08期

2 刘肖萍;张志远;刘玉松;赵琳;范旭;徐红运;张凤华;夏平安;崔保安;;猪IgGⅡB类Fc受体剪接异构体胞外区及结构域的原核表达与抗体制备[J];河南农业大学学报;2011年03期

3 蔡宝祥;;我国高致病性猪繁殖与呼吸综合征研究进展[J];畜牧与兽医;2010年10期

4 徐红运;夏平安;王中明;张凤华;卢高峰;刘玉松;崔保安;;猪肺巨噬细胞FcγR Ⅲ受体基因的克隆与序列分析[J];中国畜牧兽医;2010年04期

5 李国娟;田永强;李建强;李宝玉;柳纪省;;猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展[J];生物技术通报;2009年12期

6 王隆柏;魏宏;陈少莺;车勇良;庄向生;陈仕龙;林长光;周伦江;黄梅清;;猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗安全性和免疫原性测定[J];福建农业学报;2007年02期

7 罗宗刚;王红宁;黄勇;柳萍;田国宝;杨鑫;罗昊;张安云;;规模化猪场繁殖障碍性疾病的血清学调查[J];养猪;2006年02期

8 杨汉春;猪免疫抑制性疾病的流行特点与控制对策[J];中国畜牧兽医;2004年05期

9 王忠,杨汉春,郭鑫,陈艳红;重组M蛋白-乳胶凝集试验检测PRRS病毒血清抗体的研究[J];中国兽医杂志;2002年07期

10 刘光清,蔡雪晖,仇华吉,郭宝清,童光志;猪繁殖与呼吸综合征的研究进展[J];中国预防兽医学报;2001年01期

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1 李娜娜;pSn受体在PRRSV-ADE中的作用及PRRSV感染小鼠模型的探讨[D];河南农业大学;2014年

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本文编号：957566