旋毛虫表皮胶原蛋白rol-6在秀丽隐杆线虫体内的表达

发布时间：2017-10-02 10:27

  本文关键词：旋毛虫表皮胶原蛋白rol-6在秀丽隐杆线虫体内的表达

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【摘要】：旋毛虫(Trichinella spiralis,T.spiralis)表皮胶原蛋白构成的表皮不仅能够维持虫体的形态和运动,还能够抵抗宿主的防御系统,保护虫体免受外界伤害。随着人类对马铃薯金线虫、苍白球胞囊线虫、血吸虫等寄生虫的表皮胶原蛋白进行研究,证明了此类蛋白会引起宿主在免疫过程中最强烈的反应,是宿主免疫系统攻击的最重要抗原。T.spiralis表皮胶原蛋白在虫体刚刚蜕皮后,合成速度很快,且每一阶段的组分与结构各不相同,但是在虫体免疫应答的功能上与其他线虫的表皮胶原蛋白相似,都会引起宿主强烈的免疫反应。近年来,人们对表皮胶原蛋白的研究主要集中在马铃薯金线虫以及血吸虫,而对T.spiralis表皮胶原蛋白rol-6的研究极少,所以利用秀丽隐杆线虫(Caenorkabditis elegans,C.elegans)表达rol-6蛋白可以为筛选旋毛虫疫苗候选抗原奠定基础。本文根据NCBI中rol-6(XM_003379120.)编码序列设计引物,提取T.spiralis总RNA,反转为cDNA作为模板并进行RT-PCR扩增,将扩增产物克隆至pMD19-T载体之后转入克隆感受态DH5α,经过PCR和Bam H1/Sal I双酶切鉴定后进行测序。结果显示克隆的序列由1023个核苷酸组成,编码340个氨基酸。利用生物信息学软件对序列结构进行分析,结果表明rol-6不仅具备表皮胶原蛋白Gly-X-Y的结构,而且具有潜在的抗原表位。本实验将rol-6编码序列克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建重组质粒pGEX-rol,经PCR和双酶切鉴定后转入大肠杆菌Tans(DE3)中,以IPTG诱导蛋白表达。SDS-PAGE电泳结果显示蛋白分子量约为61KD,其中载体中的GST标签蛋白约为26 KD,rol-6蛋白约为35 KD,结果与预期相符。利用电洗脱方法纯化重组蛋白并将其免疫小鼠制备多克隆抗体,经western blot检测,成功获得鼠抗rol-6血清。为了进一步表达rol-6的活性蛋白,实验中采用PCR方法从C.elegans基因组DNA中扩增sqt-1 5'端侧翼序列(5'-FSsqt-1)作为启动子,将5'-FSsqt-1、rol-6编码序列克隆至含有绿色荧光蛋白GFP的启动子验证载体pPD95.77,构建重组质粒pPD-FSsqt-rol-GFP,通过显微注射技术,将质粒注射到C.elegans生殖腺内并培养5~7 d。结果显示,启动子5'-FSsqt-1能够启动rol-6与GFP融合蛋白在C.elegans体内瞬时表达。T.spiralis与C.elegans都属于线虫,具有一定的亲缘关系,T.spiralis抗原rol-6能够在C.elegans体内表达,其选择性剪接、糖基化修饰以及构象折叠就会更加接近天然抗原,从而使抗原活性增强,且表达过程方便简单,为研制T.spiralis疫苗提供便利。
【关键词】：旋毛虫 rol-6蛋白 sqt-1的5'端侧翼序列 秀丽隐杆线虫
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7
【目录】：

• 摘要8-9
• Abstract9-11
• 1 前言11-16
• 1.1 旋毛虫保护性抗原的分类11
• 1.2 表皮胶原蛋白的研究进展11-13
• 1.2.1 表皮胶原蛋白的概述11
• 1.2.2 表皮胶原蛋白的生物合成11-12
• 1.2.3 表皮胶原蛋白的组成12
• 1.2.4 表皮胶原蛋白的结构特征12
• 1.2.5 旋毛虫表皮胶原蛋白的功能12-13
• 1.3 秀丽隐杆线虫在寄生性线虫抗原研究中的应用13-15
• 1.3.1 秀丽隐杆线虫简介13-14
• 1.3.2 秀丽隐杆线虫作为表达系统的优势14
• 1.3.3 利用秀丽隐杆线虫表达盘尾丝状线虫蛋白14
• 1.3.4 利用秀丽隐杆线虫表达人的马来布鲁丝虫alt相关抗原14
• 1.3.5 利用秀丽隐杆线虫表达捻转血矛线虫半胱氨酸蛋白酶14-15
• 1.4 研究目的和意义15-16
• 2 材料与方法16-30
• 2.1 材料16-17
• 2.1.1 虫种和实验动物16
• 2.1.2 菌株和载体16
• 2.1.3 主要试剂16
• 2.1.4 主要仪器和设备16-17
• 2.1.5 主要软件及网络资源17
• 2.2 试验方法17-30
• 2.2.1 旋毛虫rol-6 基因的克隆和序列分析17-21
• 2.2.2 重组表达质粒pGEX-rol的构建21-22
• 2.2.3 pGEX-rol（DE3）的诱导表达及条件优化22-23
• 2.2.4 重组蛋白纯化与Western Blot检测23
• 2.2.5 重组蛋白多抗制备23-24
• 2.2.6 启动子sqt-1 的 5'端侧翼序列的克隆24-25
• 2.2.7 重组表达质粒pPD-FSsqt-GFP的构建25-26
• 2.2.8 重组表达质粒pPD-rol-GFP的构建26-27
• 2.2.9 重组表达质粒pPD-FSsqt-rol-GFP的构建27-28
• 2.2.10 秀丽隐杆线虫的显微注射及荧光观察28-29
• 2.2.11 秀丽隐杆线虫表达的rol-6 蛋白Western Blot检测29-30
• 3 结果30-43
• 3.1 旋毛虫rol-6 基因克隆结果30-33
• 3.1.1 rol-6 编码序列扩增结果30
• 3.1.2 重组克隆质粒pMD-rol的鉴定30-31
• 3.1.3 rol-6 基因分析结果31-33
• 3.2 重组表达质粒pGEX-rol的鉴定33
• 3.3 诱导表达结果33-37
• 3.3.1 pGEX-rol重组蛋白的表达鉴定33-34
• 3.3.2 诱导pGEX-rol（DE3）时间的优化34
• 3.3.3 诱导pGEX-rol（DE3）IPTG浓度的优化34-35
• 3.3.4 诱导pGEX-rol（DE3）温度的优化35
• 3.3.5 重组蛋白的可溶性分析35-36
• 3.3.6 重组蛋白Western Blot检测结果36
• 3.3.7 重组蛋白多克隆抗体的效价36
• 3.3.8 多克隆抗体Western Blot检测36-37
• 3.4 启动子sqt-1 的 5'端侧翼序列的克隆37-40
• 3.4.1 sqt-1 的 5'端侧翼序列的扩增37
• 3.4.2 重组克隆质粒pMD-FSsqt的鉴定37-38
• 3.4.3 sqt-1 的 5'端侧翼序列分析结果38-40
• 3.5 重组表达质粒pPD-FSsqt-GFP的构建40
• 3.6 重组表达质粒pPD-rol-GFP40-41
• 3.7 重组表达质粒pPD-FSsqt-rol-GFP的鉴定41
• 3.8 秀丽隐杆线虫显微注射后的荧光观察41-42
• 3.9 秀丽隐杆线虫表达的rol-6 蛋白Western Blot检测结果42-43
• 4 讨论43-45
• 4.1 旋毛虫rol-6 基因的克隆和序列分析43
• 4.2 旋毛虫rol-6 基因的原核表达及多抗制备43-44
• 4.3 启动子sqt-1 的 5'端侧翼序克隆与启动活性的验证44
• 4.4 旋毛虫rol-6 基因在秀丽隐杆线虫体内的表达44-45
• 5 结论45-46
• 致谢46-47
• 参考文献47-51
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文51

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本文编号：959115