隔孢伏革菌植酸酶在毕赤酵母中的高效表达研究

发布时间：2017-10-02 23:34

  本文关键词：隔孢伏革菌植酸酶在毕赤酵母中的高效表达研究

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【摘要】：植酸酶作为在饲料添加剂添加于单胃动物饲料中,可提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收率,并减轻动物粪便中磷对环境的污染,植酸酶的喂养效果已得到了确认,因此具有极高的应用价值,但植酸酶在天然材料中含量太低,难以获得大量产品,价格昂贵；同时酶的热稳定性难以完全满足饲料加工的要求。因此,提高植酸酶基因的表达水平,改善植酸酶的稳定性是一个函待解决的问题。本研究按照毕赤酵母对遗传密码子的偏好性,利用重叠PCR方法人工合成6-phyA,将其插入到pPIC9K载体,构建成6-phyA整合型毕赤酵母表达载体,通过电转化转入GS115酵母细胞,并筛选出Mur高拷贝转化子,建立了隔孢伏革菌植酸酶分泌表达量高的毕赤酵母株。主要结果如下：1.根据GenBank隔孢伏革菌植酸酶编码序列成功合成34条引物,并利用重叠延伸PCR技术合成了6-PhyA基因。对合成的植酸酶序列进行了毕赤酵母密码子嗜好性分析,结果较为理想,经软件分析,其翻译为氨基酸序列与野生型100%同源。2-通过对信号肽的选择开展研究,试图通过6-PhyA本身的信号肽与仪信号肽相融合,以促进植酸酶的表达,但是效果不理想,通过用酿酒酵母细胞研究6-PhyA野生型信号肽作用,发现在强启动子GPD的驱动下,未发现其能介导6-PhyA在酿酒酵母细胞中的表达,由此证明,野生型信号肽的存在并不能促进植酸酶的表达。3.将植酸酶基因克隆到表达载体pPIC9K中,电击化转入毕赤酵母GS115,获得重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K/L6ph。经甲醇诱导72h后,产酶量达到最高峰,酶活力达到23.7U/mL,实现了植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达。4.对植酸酶酶学性质的研究表明,SDS-PAGE分析表明表达植酸酶的分子量为50 kD左右。PhyA植酸酶最适温度为37-C,最适pH值为5.5,适合单胃动物的消化道环境；在55℃作用60min后,残余酶活是味保温处理的样品活性的44%,超过55℃保温处理,酶活急剧下降；金属离子对植酸酶的活性没有影响。
【关键词】：植酸酶 PhyA基因 毕赤酵母 信号肽 高效表达
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S816.7
【目录】：

• 摘要2-3
• Abstract3-8
• 符号说明8-9
• 第一章 隔孢伏革菌(Peniophora lycii)的植酸酶基因的合成与克隆9-16
• 1 材料与方法9-12
• 1.1 引物的设计9-10
• 1.2 6-磷酸植酸酶(6-PhyA)基因的合成10-11
• 1.3 6-PhyA毕赤酵母密码子嗜好分析11
• 1.4 PCR产物的克隆11-12
• 2 结果12-15
• 2.1 L6ph密码子的毕赤酵母嗜好分析12-14
• 2.2 pUC57/6-PhyA转化子质粒14-15
• 3 本章小结15-16
• 第二章 含野生型信号肽6-PhyA基因在毕赤酵母中的表达研究16-28
• 1 材料与方法16-23
• 1.1 毕赤酵母分泌型表达载体的构建16-18
• 1.2 毕赤酵母细胞的转化18-21
• 1.3 6ph在毕赤酵母中的表达21
• 1.4 植酸酶的生物学性质的测定21-23
• 2 结果23-27
• 2.1 毕赤酵母表达载体pPIC9K/6ph的酶切鉴定23-24
• 2.2 毕赤酵母转化子的筛选24-25
• 2.3 6ph在毕赤酵母中表达25
• 2.4 植酸酶活性的检测25-27
• 3 本章小结27-28
• 第三章 含野生型信号6ph基因的表达研究28-38
• 1 材料与方法28-34
• 1.1 GPD驱动的植酸酶酵母表达载体的构建28-32
• 1.2 酿酒酵母细胞的转化与鉴定32-33
• 1.3 植酸酶活性的鉴定33-34
• 2 结果34-37
• 2.1 表达载体pGPD-6ph-1的构建34-35
• 2.2 pGPD-6ph酿酒酵母表达载体的构建35-37
• 2.3 W303-1A/pGPD-6ph细胞PCR鉴定37
• 2.4 植酸酶的表达鉴定37
• 3 本章小结37-38
• 第四章 α信号肽引导的6ph基因在毕赤酵母中的表达研究38-44
• 1 材料与方法38-40
• 1.1 无野生型信号肽6-磷酸植酸酶基因的PCR扩增38
• 1.2 pPIC9K/L6ph的构建38-39
• 1.3 pPIC9K/L6ph阳性转化子的鉴定39
• 1.4 高拷贝L6ph毕赤酵母的建立39
• 1.5 毕赤酵母转化子的PCR鉴定39
• 1.6 植酸酶活性的鉴定39-40
• 2 结果40-43
• 2.1 pPIC9K/L6ph转化子质粒的酶切鉴定40-41
• 2.2 GS115毕赤酵母转化子的PCR鉴定41-42
• 2.3 植酸酶活性的检测42-43
• 3 本章小结43-44
• 第五章 植酸酶的酶学性质的研究44-48
• 1 材料与方法44-45
• 1.1 时间对酶活性的影响44
• 1.2 植酸酶最适反应温度的研究44
• 1.3 植酸酶最适pH的研究44
• 1.4 植酸酶热稳定性的研究44
• 1.5 金属离子对酶活性影响的测定44-45
• 2 结果45-48
• 2.1 培养时间对产酶的影响45
• 2.2 温度对酶活性的影响45-46
• 2.3 植酸酶的最适pH46
• 2.4 植酸酶的热稳定性46-47
• 2.5 金属离子对植酸酶的影响47-48
• 第六章 讨论48-51
• 1 酵母表达系统48
• 2 外源性基因在酵母细胞中的高效表达48-49
• 3 植酸酶的酶学性质49-50
• 4 未来展望50-51
• 参考文献51-54
• 综述54-63
• 参考文献61-63
• 攻读学位期间发表的学术论文63-64

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