表面展示柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白重组乳酸菌的构建及免疫保护效果研究
发布时间：2017-10-03 13:36
本文关键词：表面展示柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白重组乳酸菌的构建及免疫保护效果研究
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【摘要】：鸡球虫病是由一种或多种艾美耳球虫寄生于肠上皮细胞内所引起的原虫病,严重阻碍养禽业发展。目前,鸡球虫病的防治主要以化学药物为主,但长期的药物防治造成耐药虫株产生和药物残留问题。因此,采用免疫防治方法已经达到共识。但现有的市售鸡球虫活疫苗存在毒力返强并造成大范围感染的隐患。活载体疫苗能够使抗原对机体的黏膜刺激作用接近自然途径,其中乳酸菌作为蛋白载体因其具有易于培养、定殖力强、免疫佐剂作用、提取方法简单等诸多优点成为研制活载体疫苗的热点。同时,随着微生物表面展示系统研究的不断深入使得外源保护性抗原蛋白可以表达在菌体表面以便更好的持续刺激机体产生针对外源蛋白的抗体,诱导相关免疫机制的产生。据研究表明聚-γ-谷氨酸合成酶A(Poly-γ-Glutamic Acid Synthetase A,pgsA)表面展示元件在将外源蛋白表达在乳酸菌表面上具有良好的效果,使得保护性抗原与细胞接触更接近自然感染状态。本实验通过构建具有表面展示作用的重组乳酸菌将柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)的保护性抗原微线体蛋白2(EtMIC2)表达在菌体表面对雏鸡进行免疫以期获得良好的抗E.tenella效果。具体研究内容及结果如下:1.EtMIC2蛋白重组乳酸菌的构建及目的蛋白表达首先应用基因工程技术获得EtMIC2蛋白基因后与pSIP409-pgsA载体相连接,转入大肠杆菌中进行扩增,酶切验证及测序结果正确后通过电转化法将重组pSIP409-pgsAEtMIC2质粒转入植物乳杆菌NC8中,酶切及测序结果验证后表明成功构建pSIP409-pgsAEtMIC2重组乳酸菌;后通过Western Blot验证蛋白表达,结果表明蛋白大小为90KDa与预期结果一致。并通过免疫荧光和流式细胞仪鉴定了目的蛋白的表面展示情况,结果表明目的蛋白能够良好的表达在菌体表面,流式细胞术检测其相对表达量为26.4%。2.重组菌对感染E.tenella雏鸡免疫水平的影响及免疫保护效果评价动物保护性试验以1~25日龄雄性肉雏鸡为实验动物,选取植物乳杆菌NC8,pSIP409-pgsA重组乳酸菌及PBS组作为对照。将同批体重相似且健康的125只1日龄肉用雏鸡随机分为A、B、C、D、E 5组,每组25只分别饲养于无自然感染途径的动物室内。雏鸡1~15日龄期间,A、B两组每隔1日饲喂前灌服PBS 200μL/只,C、D、E三组每隔1日灌服各自相应菌种2×108CFU/200μL,其中C组灌服重组菌pSIP409-pgsA-EtMIC2,D组灌服pSIP409-pgsA重组菌,E组灌服植物乳杆菌NC8。雏鸡15日龄时,每组处死10只进行外周血中淋巴细胞增殖能力、CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+T淋巴细胞含量的检测、抗体IgG含量及食糜中SIgA含量及细胞因子IL-2和IFN-γ分泌量的检测。除A组外其它各组余下雏鸡分别于15日龄经口接种已孢子化的E.tenella卵囊5×104个/只,攻虫10天后,于25日龄处死全部雏鸡,除检测上述指标外,对鸡只的相对增重率、盲肠病变记分以及盲肠内容物的卵囊值、OPG、等数据进行统计,对病理切片进行观察分析,计算出抗球虫指数。(1)重组菌对感染E.tenella雏鸡免疫水平的影响:球虫感染前、后雏鸡15日龄和25日龄分别对各组雏鸡进行免疫指标检测,结果表明,服用各自相应乳酸菌后感染前、后均能够提高雏鸡外周血中淋巴细胞的增殖能力,其中pSIP409-pgsA-EtMIC2重组乳酸菌组(C组)与对照组(A组)、虫组(B组)两组相比差异显著(P0.05)。同时乳酸菌在球虫感染前后均能够促进外周血中CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+T淋巴细胞的生成,其中C组与A、B、D三组相比差异显著(P0.05)。此外乳酸菌在球虫感染前后能够提高外周血中细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌量,且能够通过提高外周血中IgG抗体及肠内容物中SIgA抗体的分泌量提高雏鸡的体液免疫水平。其中pSIP409-pgsA-EtMIC2重组乳酸菌组效果最佳,植物乳杆菌NC8组和pSIP409-pgsA重组乳酸菌组差异不显著(P0.05)。(2)重组菌对鸡E.tenella的免疫保护效果评价:结果表明,在球虫感染前、后,灌服乳酸菌的3组雏鸡其平均增重均比B组高,且pSIP409-pgsA-EtMIC2重组乳酸菌组(C组)和虫组(B组)相比差异显著(P㩳0.05);C、D、E三组灌服乳酸菌组的雏鸡其盲肠病变记分均低于未灌服乳酸菌的虫组鸡只(B组),且C组最低;B组雏鸡盲肠病变最严重,盲肠病变记分平均值达到3.75,显著高于其它乳酸菌组(P㩳0.05);灌服乳酸菌的C、D、E三组雏鸡其卵囊排出量均低于B组,且pSIP409-pgsA-EtMIC2重组乳酸菌组(C组)最低;灌服乳酸菌的C、D、E三组雏鸡其抗球虫指数分别为145.15、115.57、126.81,C组在120~160之间,表明其具有中等的抗球虫效果。证明了pSIP409-pgsA-EtMIC2重组乳酸菌对柔嫩艾美耳球虫具有一定的保护作用,为鸡球虫病的免疫防治提供了新思路。
【关键词】：鸡球虫病 重组乳酸菌 EtMIC2 pgsA 免疫保护效果
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31
【目录】：
- 摘要4-6
- Abstract6-11
- 前言11-12
- 第一篇 文献综述12-19
- 第一章 鸡球虫的种类和免疫防治12-16
- 1.1 鸡球虫种类及生活史12
- 1.2 鸡球虫病的相关免疫机制12-13
- 1.3 鸡球虫病的免疫防治进展13-14
- 1.4 柔嫩艾美耳球虫Et MIC2蛋白应用研究进展14-15
- 1.5 结语15-16
- 第二章 乳酸菌的作用及其表面展示系统pgs A研究进展16-19
- 2.1 乳酸菌益生作用16
- 2.2 乳酸菌免疫调节作用16-17
- 2.3 乳酸菌抗球虫作用17
- 2.4 乳酸菌表面展示元件pgs A17-18
- 2.5 结语18-19
- 第二篇 研究内容19-56
- 第一章 重组质粒p SIP409-pgs A- Et MIC2的构建及其在乳酸菌中的表达19-34
- 1. 材料和方法19-27
- 2. 结果27-33
- 3. 讨论33
- 4. 小结33-34
- 第二章 pSIP409-pgs A- Et MIC2重组乳酸菌抗E.tenella免疫保护效果检测34-56
- 2.1. 材料和方法34-40
- 2.2. 结果40-54
- 2.3. 讨论54-55
- 2.4. 小结55-56
- 结论56-57
- 参考文献57-63
- 附录63-64
- 作者简介64-65
- 致谢65
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，本文编号：965517
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