小尾寒羊三个慢型骨骼肌肌钙蛋白的基因克

发布时间：2017-10-03 20:21

  本文关键词：小尾寒羊三个慢型骨骼肌肌钙蛋白的基因克隆、结构特征及组织表达分析

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【摘要】：慢型骨骼肌肌钙蛋白基因主要包括肌钙蛋白C 1基因(Troponin C type 1,TNNC1)、肌钙蛋白I 1基因(Troponin I type 1,TNNI1)和肌钙蛋白T 1基因(Troponin T type 1,TNNT1),它们对骨骼肌的收缩、骨骼肌肌肉纤维特性及多种疾病的发生有密切关系。目前,有关绵羊的TNNC1、TNNI1和TNNT1基因的全长核酸序列未见报道。本试验采用RT-PCR、RACE、生物信息学分析、荧光定量PCR等技术方法,克隆了小尾寒羊TNNC1、TNNI1和TNNT1基因的全长序列,预测分析了其对应蛋白的序列和特性,构建了其在小尾寒羊和杜泊羊多种组织的表达谱,从分子水平上探索了小尾寒羊三个基因的主要结构和表达特性。主要结果如下:(1)克隆测序得到了小尾寒羊TNNC1、TNNI1和TNNT1基因的cDNA序列,其中TNNI1包含两个5′端有区别的序列,并分别命名为TNNI1a和TNNI1b。得到的TNNC1、TNNI1a和TNNT1基因的全长cDNA序列及TNNI1b基因的部分cDNA序列已提交至GenBank,并分别获得登录号为KR153938、KT218688、KT218689及KT218690。相应的编码氨基酸长度分别为161、187、194和263个氨基酸。(2)cTnC蛋白为偏酸性蛋白,且结构比较稳定,亲水性比较好,流动性比较大;ssTnI蛋白两种亚型均为偏碱性蛋白,且结构相对不稳定,亲水性比较好;ssTnT蛋白为偏酸性蛋白,流动性一般,结构不是很稳定,但亲水性比较好,流动性比较大。cTnC、ssTnI和ssTnT蛋白均没有跨膜结构域,含有多个磷酸化位点,无任何N-糖基化位点,预测为非分泌性蛋白质。二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主。(3)多物种氨基酸序列比对结果显示:cTnC蛋白的氨基酸序列在本试验分析的物种中高度保守。ssTnI两亚型蛋白和ssTnT蛋白的氨基酸序列均与试验中其它哺乳动物的保守性比较高,而与试验中其它的非哺乳动物的保守性相对较差。系统进化树结果显示:绵羊的cTnC蛋白最先与野猪、家牛和山羊聚到一类;绵羊的ssTnI蛋白最先与山羊和家牛聚到一类;绵羊的ssTnT蛋白最先与野猪和家牛聚到一类。上述结果表明小尾寒羊中的cTnC、ssTn I和ssTnT蛋白均与试验中的其它哺乳动物的关系比较近。(4)TNNC1、TNNI1和TNNT1基因在小尾寒羊和杜泊羊的多种组织中的表达情况不同,然而,这几个基因的表达模式却存在一定的共性。TNNC1、TNNI1和TNNT1基因均在肋间肌、股二头肌和背最长肌中高表达,且其表达量均为肋间肌股二头肌背最长肌。小尾寒羊和杜泊羊中TNNI1a基因在每个组织中的表达量都高于TNNI1b基因在各组织中的表达量。此外,TNNC1、TNNI1和TNNT1基因在小尾寒羊和杜泊羊两品种羊中的表达量也存在明显的区别。特别的,TNNI1a在小尾寒羊肋间肌中的表达量显著高于其在杜泊羊中的表达量(p0.05)。三个基因对应的蛋白均在背最长肌、肋间肌、股二头肌中存在表达,此外,在两品种羊的心肌中,cTnC蛋白也存在表达,而ssTn I和ssTnT蛋白则不存在表达。综上所述,本试验成功克隆了小尾寒羊的TNNC1、TNNI1和TNNT1基因,并对其展开了较为系统的研究。从分子水平探索上述基因的特性及功能,为后续基因功能的研究和分子育种提供基本的理论依据。
【关键词】：小尾寒羊 杜泊羊 cTnC蛋白 ssTn I蛋白 ssTnT蛋白 组织表达
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S826
【目录】：

• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 1 前言11-24
• 1.1 小尾寒羊和杜泊羊11-12
• 1.1.1 小尾寒羊11-12
• 1.1.2 杜泊羊12
• 1.2 肌钙蛋白家族的研究进展12-18
• 1.2.1 TnC蛋白14-15
• 1.2.2 TnI蛋白15-17
• 1.2.3 TnT蛋白17-18
• 1.3 慢肌型肌钙蛋白基因研究进展18-21
• 1.3.1 TNNC118-19
• 1.3.2 TNNI119-20
• 1.3.3 TNNT120-21
• 1.4 肌钙蛋白互作关系21-23
• 1.4.1 TnC蛋白的互作关系21-22
• 1.4.2 TnI蛋白的互作关系22
• 1.4.3 TnT蛋白的互作关系22-23
• 1.5 本研究目的意义23-24
• 2 材料与方法24-40
• 2.1 试验材料24-26
• 2.1.1 试验组织样品的采集24
• 2.1.2 试验仪器设备24-25
• 2.1.3 试验试剂25
• 2.1.4 配制常用试剂25-26
• 2.2 试验方法26-40
• 2.2.1 绵羊各组织总RNA的提取26-27
• 2.2.2 cDNA的合成27-28
• 2.2.3 目的基因选择及引物设计28-29
• 2.2.4 小尾寒羊TNNC1、TNNI1和TNNT1基因的克隆29-35
• 2.2.5 基因及编码的蛋白序列的特征分析35-36
• 2.2.6 基因TNNC1、TNNI1及TNNT1的荧光定量PCR分析36-37
• 2.2.7 蛋白免疫印迹分析37-40
• 3 结果与分析40-70
• 3.1 基因全长cDNA克隆结果及其序列特征40-43
• 3.1.1 TNNC1基因克隆结果及其序列特征40-41
• 3.1.2 TNNI1基因克隆结果及序列特征41-42
• 3.1.3 TNNT1基因克隆结果及序列特征42-43
• 3.2 蛋白质序列分析43-61
• 3.2.1 蛋白质一级序列分析43-46
• 3.2.2 蛋白质二级结构及超二级结构分析46-52
• 3.2.3 蛋白质三级结构52-55
• 3.2.4 蛋白质氨基酸序列的同源性比对及系统进化分析55-61
• 3.3 小尾寒羊和杜泊羊TNNC1、TNNI1和TNNT1基因mRNA组织表达61-70
• 3.3.1 标准曲线及熔解曲线分析61-62
• 3.3.2 小尾寒羊和杜泊羊TNNC1、TNNI1和TNNT1基因mRNA组织表达62-66
• 3.3.3 小尾寒羊和杜泊羊cTnC、ssTn I和ssTnT蛋白组织表达66-70
• 4 讨论70-74
• 4.1 cTnC、ssTn I和ssTnT蛋白的结构与功能间的关系70-72
• 4.2 cTnC、ssTn I和ssTnT蛋白氨基酸序列同源性及其进化分析72
• 4.3 TNNC1、TNNI1和TNNT1基因mRNA表达分析72-73
• 4.4 cTnC、ssTn I和ssTnT蛋白表达分析73-74
• 5 结论74-75
• 参考文献75-84
• 致谢84-85
• 攻读学位期间发表论文情况85

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：966501