绵羊MITF-M在黑素细胞中过表达后的功能分析

发布时间：2017-10-05 17:27

  本文关键词：绵羊MITF-M在黑素细胞中过表达后的功能分析

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【摘要】：【目的】小眼畸形相关转录因子-M型(microphthalmia associated transcription factor M,MITF-M)在动物皮肤和毛发的黑色素合成途径中发挥重要作用,克隆绵羊小眼畸形相关转录因子-M型基因序列,研究在绵羊黑素细胞中过表达绵羊MITF-M是否影响TYR、TYRP-1和TYRP-2的表达,从而探究对黑色素的生成的影响。【方法】使用试验室冻存的第5代绵羊黑素细胞,通过PCR方法用引物以绵羊黑素细胞cDNA为模板克隆MITF-M基因cDNA序列,构建绵羊MITF-M克隆载体和真核表达载体;通过细胞转染技术在细胞水平过量表达绵羊MITF-M;转染后使用荧光显微镜观察细胞转染效率,采用分光光度计对绵羊黑素细胞中黑色素含量进行测定,并进行Real-time PCR试验检测转染后细胞MITF、TYR、TYRP-1和TYRP-2基因在mRNA水平表达量的变化,Western blot试验检测转染后细胞MITF、TYR蛋白水平的变化。【结果】经测序和拼接,最终获得长度为1 242 bp的绵羊MITF-M基因的cDNA序列;成功构建真核表达载体,载体上连有一个启动报告基因绿色荧光蛋白和特异性TYRP-2基因启动子;细胞转染后,在荧光显微镜下可观察到黑素细胞带有绿色荧光说明转染效率明显;分光光度计检测显示,转染后绵羊黑素细胞中黑色素量增加1.15倍(P0.05);荧光定量检测结果显示,绵羊黑素细胞中MITF mRNA表达量增加极显著(P0.001),表明绵羊MITF-M转染效率显著,TYR mRNA表达量增加极显著(P0.001),TYRP-1 mRNA表达量升高至5.06倍(P0.05),TYRP-2 mRNA表达量升高至1.49倍,变化不明显。蛋白免疫印迹结果显示,绵羊黑素细胞中MITF-M转染组MITF蛋白表达量是空载体组的1.65倍(P0.001),转染组TYR蛋白表达量是空载体组的2.38倍(P0.001),这与荧光定量检测结果一致。【结论】通过PCR和克隆技术及核酸测序技术获得了绵羊MITF-M基因全长1 242 bp的CDS区,过表达绵羊MITF-M会使黑素细胞TYR、TYRP-1的表达量增加,对TYRP-2的表达量变化不明显,从而揭示绵羊MITF-M可以通过调节TYR和TYRP-1的表达量控制绵羊黑素细胞中黑色素的生成。
【作者单位】： 山西农业大学动物科技学院;山西医科大学晋祠学院;山西医科大学基础医学院;
【关键词】： 小眼畸形相关转录因子(MITF) TYR TYRP- TYRP-
【基金】：国家公益性行业(农业)科研专项(201303119) 国家高科技研究发展计划(863计划,2013AA102506) 山西农业大学创新团队
【分类号】：S826
【正文快照】： The Function Analysis of Over-Expression ofOar MITF-M in MelanocytesYANG Yu-jing1,ZHANG DAN-Jin2,NIE Rui-qiang1,XIE Jian-shan1,3,FAN Rui-wen1,【研究意义】绵羊毛是毛纺工业最主要原料,毛色成为了主要经济特性。如今研究毛色种类,成为毛色研究的主要方向,而毛色的

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本文编号：978071