基于细胞自噬对车前草多糖的免疫药理机制研究

发布时间：2017-10-06 00:34

  本文关键词：基于细胞自噬对车前草多糖的免疫药理机制研究

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【摘要】：车前草最早记载于《神农本草经》,是《中国药典》(2015年版)收载的常用中药,具有清热解毒、祛痰利尿之功效。现代药理学研究发现车前草中含有多糖类、黄酮类、熊果酸及苷类等多种活性成分,具有镇咳平喘、抗菌和抗氧化等作用。近期的一些研究发现,车前草的多糖成分——车前草多糖(Plantago asiatica Polysaccharide,PLP)在促进动物机体免疫器官发育、免疫细胞增殖以及提高疫苗免疫抗体效价等方面都具有明显的效果,但其免疫药理作用机理尚不明确。细胞自噬(Autophagy)是机体固有免疫和适应性免疫的重要组成部分,参与病原的清除、炎症反应以及抗原呈递等方面的作用。研究发现,自噬信号调控途径的mTOR(Mammalian Target of Rapamycin)调控途径和mTOR不依赖性(Ⅲ-PI3K)调控途径,同时也是免疫分子及药物进行免疫调节的有效途径。近年来,一些中药及有效成分如姜黄素、苦参碱、氨茶碱诱导肿瘤细胞、免疫细胞发生自噬的研究,使细胞自噬成为了探索中医药药理作用机制的新途径。本研究基于细胞自噬调控途径以及细胞自噬与固有免疫的TLR4/NF-κB信号通路的交互作用,研究车前草多糖对细胞自噬的调节作用及其免疫药理作用机制,拟明确车前草多糖的免疫药理作用靶位,为车前草多糖成为一种新型免疫调节剂提供试验依据。试验主要结果及结论如下:1.车前草多糖对LPS诱导巨噬细胞自噬的影响试验以LPS诱导Raw264.7巨噬细胞发生自噬,分别以车前草多糖的低(25μg/mL)、中(50μg/mL)、高(100μg/mL)三种不同剂量进行干预,用MDC荧光染色检测自噬体的聚积程度,用Western-blot检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1的蛋白表达水平,和用荧光定量PCR检测自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的mRNA表达水平,研究车前草多糖对LPS诱导细胞自噬的调节作用。试验结果显示,车前草多糖使LPS诱导产生的自噬体荧光聚积增多;对LC3Ⅱ/Ⅰ比值及LC3 mRNA表达水平、Beclin-1的蛋白及mRNA表达水平均有不同程度的上调作用。其中,车前草多糖中剂量干预组的LC3Ⅱ/Ⅰ比值在20h时显著高于LPS组(P0.01),LC3 mRNA表达水平在2h、16h、20h、24h时显著高于LPS组(P0.05);车前草多糖高剂量干预组的LC3Ⅱ/Ⅰ比值在16h、20h、24h显著高于LPS组(P0.05或P0.01),LC3 mRNA表达水平在2h、16h、20h、24h时显著高于LPS组(P0.05)。车前草多糖中剂量干预组的beclin-1蛋白表达水平在16h、20h、24h时显著高于lps组(p0.05或p0.01),beclin-1mrna表达水平在16h时显著高于lps组(p0.05);车前草多糖高剂量干预组的beclin-1蛋白表达水平在16h、20h、24h时显著高于lps组(p0.01),beclin-1mrna表达水平在2h、8h、16h、20h显著高于lps组(p0.05或p0.01)。试验结果表明,车前草多糖能促进巨噬细胞的自噬体数量增加,上调lc3和beclin-1的表达水平,对lps诱导的巨噬细胞自噬具有促进作用。2.车前草多糖对细胞自噬mtor和Ⅲ-pi3k调控通路的影响通过对细胞自噬mtor和Ⅲ-pi3k调控通路的正向试验及阻断试验,研究车前草多糖调节细胞自噬的分子机制。试验以lps诱导raw264.7细胞发生自噬,并分别使用抑制剂——雷帕霉素(rapamycin)和3-甲基腺嘌呤(3-ma)对mtor和Ⅲ-pi3k调控通路进行阻断,用western-blot和荧光定量pcr技术检测自噬调控通路相关分子mtor、ulk1、beclin-1、Ⅲ-pi3k的蛋白及mrna表达水平。试验结果显示,lps组与空白对照组相比,lc3Ⅱ/Ⅰ比值及lc3mrna表达水平显著增高(p0.01),mtor蛋白及mrna表达减少(p0.05),ulk1的蛋白及mrna表达增加(p0.05);Ⅲ-pi3k蛋白及mrna表达增加(p0.05),beclin-1的蛋白及mrna表达显著增加(p0.05或p0.01)。车前草多糖干预后,与lps组比较,lc3Ⅱ/Ⅰ比值显著增高(p0.05),ulk1和Ⅲ-pi3k的蛋白表达水平增高但差异不显著(p0.05),beclin-1的蛋白及mrna表达水平显著增高(p0.05或p0.01)。当雷帕霉素抑制mtor通路时,lc3Ⅱ/Ⅰ比值及lc3mrna表达水平较lps组显著增高(p0.05或p0.01),其中lps+rapa+plp组显著低于lps+rapa组(p0.05或p0.01);ulk1的蛋白及mrna表达水平较lps组无显著差异(p0.05),其中lps+rapa+plp组的ulk1蛋白表达水平显著高于lps+rapa组(p0.05)。当3-ma抑制Ⅲ-pi3k通路时,lc3Ⅱ/Ⅰ比值及lc3mrna表达水平较lps组显著降低(p0.01),其中lps+3-ma+plp组与lps+3-ma组之间无显著差异(p0.05);beclin-1的蛋白及mrna表达水平较lps组显著降低(p0.05),其中lps+3-ma+plp组的beclin-1蛋白表达水平显著低于lps+3-ma组(p0.05)。试验结果表明,车前草多糖可通过激活Ⅲ-pi3k通路促进细胞自噬,其作用机制与上调ulk1和beclin-1的表达有关。3.车前草多糖在tlr4/nf-κb通路与自噬调控通路交互作用中的调节机制通过对tlr4/nf-κb通路与自噬调控通路的正向和阻断试验,研究车前草多糖在固有免疫的tlr4/nf-κb信号通路与自噬调控通路交互作用中的调节机制。试验以lps诱导raw264.7细胞发生自噬,使用雷帕霉素和3-ma分别阻断mtor和Ⅲ-pi3k自噬调控通路,通过荧光定量pcr检测tlr4/nf-κb通路中tlr4、myd88、trif、nf-κb的mrna表达水平、及western-blot检测nf-κbp65的磷酸化水平的变化;并用抑制剂bay11-7082阻断nf-κb通路,用western-blot和荧光定量pcr检测自噬相关分子lc3、beclin-1、Ⅲ-pi3k、mtor的蛋白及mRNA表达水平的变化。结果显示,LPS处理Raw264.7细胞后,TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA表达水平以及NF-κB p65磷酸化水平较空白对照组显著增高(P0.05或P0.01)。经车前草多糖干预后,TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA表达水平以及NF-κB p65磷酸化水平较LPS组均有不同程度的升高。当雷帕霉素抑制mTOR通路时,NF-κB p65的磷酸化水平较LPS组显著降低(P0.01),其中LPS+Rapa组和LPS+Rapa+PLP组之间无显著差异(P0.05);TRIF mRNA表达水平较LPS组显著增高(P0.05或P0.01),并且LPS+Rapa+PLP组显著低于LPS+Rapa组(P0.05)。当3-MA抑制Ⅲ-PI3K通路时,NF-κB mRNA表达水平较LPS组显著增高(P0.01),其中LPS+3-MA+PLP组低于LPS+3-MA组但无显著差异(P0.05)。当BAY11-7082抑制NF-κB通路时,LC3Ⅱ/Ⅰ比值及LC3 mRNA表达水平较LPS组明显降低,其中LPS+BAY+PLP组和LPS+BAY组之间无显著差异(P0.05);mTOR的蛋白及mRNA表达水平较LPS组显著增高(P0.05或P0.01),其中LPS+BAY+PLP组和LPS+BAY组之间无显著差异(P0.05);Beclin-1的蛋白及mRNA表达水平较LPS组显著降低(P0.05或P0.01),其中LPS+BAY+PLP组的Beclin-1蛋白表达水平显著低于LPS+BAY组(P0.01);Ⅲ-PI3K的mRNA表达水平较LPS组显著降低(P0.01),其中LPS+BAY+PLP组和LPS+BAY组之间无显著差异(P0.05)。研究结果表明,车前草多糖可通过协同激活TLR4/NF-κB信号通路促进LPS诱导的自噬,在自噬通路与TLR4/NF-κB通路的交互作用中,Ⅲ-PI3K通路和TLR4/NF-κB通路中的重要节点分子为车前草多糖调节自噬与固有免疫的潜在靶标。
【关键词】：车前草多糖 自噬 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶 巨噬细胞
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S853.74
【目录】：

• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 第1章 文献综述14-24
• 1.1 车前草多糖的研究概况14-15
• 1.2 细胞自噬与免疫15-21
• 1.3 细胞自噬在中药药理机制中的研究21-24
• 第2章 引言24-26
• 2.1 研究目的与意义24
• 2.2 研究范围与内容24-26
• 第3章 车前草多糖对LPS诱导巨噬细胞自噬的影响26-42
• 3.1 试验材料26-27
• 3.2 试验方法27-32
• 3.3 试验结果32-39
• 3.4 讨论39-42
• 第4章 车前草多糖对细胞自噬Ⅲ-PI3K和mTOR调控通路的影响42-52
• 4.1 试验材料42
• 4.2 试验方法42-43
• 4.3 试验结果43-50
• 4.4 讨论50-52
• 第5章 车前草多糖在TLR4/NF-κB通路与自噬调控通路交互作用中的调节机制52-62
• 5.1 试验材料52-53
• 5.2 试验方法53
• 5.3 试验结果53-59
• 5.4 讨论59-62
• 第6章 结论62-64
• 参考文献64-72
• 附录 172-73
• 附录 273-76
• 致谢76

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本文编号：979734