牛早期胚胎发育中JPX影响XIST表达的研究

发布时间：2017-10-06 12:30

  本文关键词：牛早期胚胎发育中JPX影响XIST表达的研究

  更多相关文章： 早期胚胎发育 X染色体失活 JPX XIST 牛

【摘要】：在哺乳动物中,雌雄个体之间为了达到X染色体上基因表达量的平衡,雌性个体会在早期胚胎发育过程中将其中一条X染色体失活(X Chromosome inactivation,XCI)。X染色体失活主要由X染色体失活中心(X Inactivation Center,XIC)介导,而位于失活中心的X染色体特异性转录体(X-chromosome inactive special transcript,XIST)在X染色体失活过程中起到主要作用。近年来对XCI失活领域的不断探索,发现了很多XIST的调节子。JPX在2002年被发现,其编码的长非编码RNA是在小鼠胚胎干细胞分化过程中发现的一个XIST的激活子,JPX通过将XIST P2启动子上的绝缘子CTCF游离出来,解除绝缘子CTCF对XIST转录的抑制作用,从而促进XIST的表达,使得XCI正常进行。敲除JPX基因对雌性的胚胎干细胞具有致死性。然而,在胚胎的早期发育中JPX是否也能影响XIST的表达,迄今无相关报道。本研究是在牛的早期胚胎中,采用体细胞核移植技术研究胚胎早期发育中JPX对XIST表达的影响。1、检测牛早期胚胎不同发育阶段中JPX和XIST的表达情况,发现JPX和XIST在牛的2细胞胚胎、4细胞胚胎、8细胞胚胎、桑椹胚和囊胚中都有表达,并且随着胚胎发育相对表达量逐步升高。2、通过QRT-PCR分别检测牛雌雄胎儿心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织中JPX和XIST的相对表达量,发现JPX和XIST在雌性胎儿组织中的相对表达量显著高于雄性胎儿组织(P0.05)。3、根据NCBI上已知的牛JPX序列通过3'-RACE PCR扩增技术将牛JPX 3'端全长660 bp扩增出来,通过测序获得JPX 3'端全长序列。4、构建针对牛JPX的JPX-pcDNA?6.2-GW/EmGFP-miR干扰载体,QRT-PCR检测到干扰效率为75%(P0.01),稳转雌性牛成纤维细胞,筛选出单细胞克隆。以获得的单细胞克隆作为供核细胞,进行体细胞核移植,并检测JPX、XIST以及X连锁基因的相对表达量,发现当JPX受到干扰后,相应胚胎时期的XIST表达量显著下降,但三个X连锁基因PGK1、DYNLT3和MSN在囊胚阶段的表达量显著上调。在牛早期胚胎发育过程中,当JPX RNA水平受到干扰后会下调XIST的表达,进而上调X-linked基因PGK1、DYNLT3和MSN的表达。
【关键词】：早期胚胎发育 X染色体失活 JPX XIST 牛
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-11
• 文献综述11-35
• 第一章 X染色体失活和XIST的研究现状11-27
• 1.1 X染色体失活11-19
• 1.1.1 X染色体失活的来源11-14
• 1.1.2 染色体失活中心14
• 1.1.3 减数分裂性染色体失活14-15
• 1.1.4 X印记失活15-16
• 1.1.5 X染色体的重新活化16
• 1.1.6 随机失活16-18
• 1.1.7 失活的维持和基因的逃逸18-19
• 1.2 XIST的研究现状19-27
• 1.2.1 XIST的简介19-20
• 1.2.2 XIST RNA的传递20-24
• 1.2.3 XIST介导多梳蛋白Polycomb的募集24-27
• 第二章 JPX的研究进展27-35
• 2.1 JPX的发现27-28
• 2.2 JPX能够逃避XCI28
• 2.3 JPX RNA作用形式28-30
• 2.4 JPX和TSIX具有拮抗性30-31
• 2.5 JPX RNA如何激活XIST的表达31-33
• 2.6 JPX对细胞的影响33-34
• 2.7 结束语和展望34-35
• 实验部分35-56
• 第三章 JPX和XIST在组织和早期胚胎中的表达模式35-42
• 3.1 实验材料35
• 3.1.1 牛胎儿和组织35
• 3.1.2 主要试剂35
• 3.1.3 主要仪器35
• 3.2 实验方法35-39
• 3.2.1 检测组织中JPX和XIST的表达情况35-36
• 3.2.2 体外受精36-37
• 3.2.3 胚胎的性别鉴定37-38
• 3.2.4 检测雌性早期胚胎中JPX和XIST的表达情况38-39
• 3.3 实验结果39-40
• 3.3.1 牛组织中JPX和XIST的表达情况39
• 3.3.2 胚胎的性别鉴定39-40
• 3.3.3 牛早期胚胎中JPX和XIST的表达情况40
• 3.4 讨论40-41
• 3.5 小结41-42
• 第四章 牛早期胚胎中JPX对XIST表达的影响42-56
• 4.1 实验材料42-43
• 4.1.1 菌株和质粒42
• 4.1.2 牛胎儿和卵巢42-43
• 4.1.3 主要试剂43
• 4.1.4 主要仪器43
• 4.2 实验方法43-50
• 4.2.1 成纤维细胞分离培养43-44
• 4.2.2 总RNA的提取44
• 4.2.3 3＇-RACE反应扩增牛JPX 3＇端全长44-46
• 4.2.4 构建JPX的干扰载体46
• 4.2.5 转化46
• 4.2.6 质粒测序鉴定46-47
• 4.2.7 无内毒素质粒的获取47
• 4.2.8 单细胞克隆的制备47-48
• 4.2.9 载体干扰效率的检测48
• 4.2.10 克隆胚的制备48-49
• 4.2.11 QRT-PCR检测SCNT胚胎发育中JPX和XIST的相对表达量49-50
• 4.2.12 实验数据分析50
• 4.3 结果50-53
• 4.3.1 牛JPX 3＇-RACE扩增结果50
• 4.3.2 干扰效率检测结果50-51
• 4.3.3 单细胞克隆筛选结果51
• 4.3.4 阳性克隆的干扰效率检测51
• 4.3.5 体细胞核移植胚胎的获得51-52
• 4.3.6 SCNT胚胎中XIST的相对表达量52-53
• 4.4 讨论53-55
• 4.5 小结55-56
• 全文总结56-57
• 参考文献57-66
• 附录66-69
• 致谢69-70
• 个人简介70

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