嵌合犬细小病毒VP2基因重组狂犬病毒的拯救与鉴定

发布时间：2017-10-07 16:23

  本文关键词：嵌合犬细小病毒VP2基因重组狂犬病毒的拯救与鉴定

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【摘要】：狂犬病是由狂犬病毒感染引起的一种人畜共患病,发病后死亡率几乎达到100%,是人类病死率最高的急性传染病之一。犬细小病毒病是由犬细小病毒感染引起的一种高度接触性传染病,主要引起犬的出血性肠炎和非化脓性心肌炎。犬细小病毒衣壳的主要成分是VP2蛋白,该蛋白可以诱导机体产生中和抗体,是研制犬细小病毒基因工程疫苗的主要蛋白。本研究首先对采集自2013~2014年河北以及甘肃的10株犬细小病毒病料进行VP2基因克隆与序列分析,并对基因型进行鉴定。结果显示,CPV-2a型占80%,CPV-2b型占20%,表明河北与甘肃地区流行的犬细小病毒病以CPV-2a型为主。然后通过原核表达系统成功表达出犬细小病毒的VP2蛋白,纯化后免疫豚鼠,制备多克隆抗体,经Western blotting分析证实了所表达的VP2蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。另外,本研究基于狂犬病毒反向遗传操作系统进行了犬细小病毒和狂犬病毒二联基因工程疫苗的研究。以致弱的狂犬病毒BNSP为载体,构建嵌合犬细小病毒VP2基因的狂犬病毒全长cDNA。将全长cDNA质粒和辅助质粒共转染Vero E6细胞,免疫荧光显示重组病毒rBNSP-CPV-VP2在细胞中拯救成功。然后对该重组病毒的生物学特性进行了鉴定,将重组病毒在Vero E6细胞中连续传8代,对第1、3、5代病毒进行滴度测定,毒价最高达109FFU/mL;RT-PCR证实了VP2基因的遗传稳定性;Western blotting显示VP2蛋白在重组病毒中成功表达。进一步利用BALB/c小鼠模型对该重组病毒的致病性和免疫特性进行了评价。小鼠致病性结果显示,注射重组病毒后,小鼠未现肉眼可见的临床症状。对重组病毒进行灭活,经安全检验合格后,与GEL佐剂按一定的比例制备疫苗,同时设抗原组和PBS对照组。于0,14天免疫小鼠两次,在7、14、21、28、35天采血,通过ELISA方法检测狂犬病毒和犬细小病毒IgG抗体,并用RFFIT的方法检测狂犬病毒中和抗体。通过ELISPOT检测细胞因子IL-4和IFN-γ的分泌水平;在28天用30个LD50的CVS进行脑内攻击,评价疫苗保护效果。ELISA和ELISPOT结果显示免疫BNSP-VP2组和BNSP-VP2+GEL组都可以诱导产生体液免疫和细胞免疫应答,GEL佐剂可以增强免疫应答水平。RFFIT实验结果表明首免后28天时BNSP-VP2组和BNSP-VP2+GEL组的中和抗体水平分别可以达到7.19 IU/mL和21.21 IU/mL。攻毒保护试验结果显示,免疫BNSP-VP2的小鼠保护率达到66.67%,免疫BNSP-VP2+GEL的小鼠保护率达到100%。综上,本研究分析了犬细小病毒在我国部分省区的流行现状,原核表达了犬细小病毒VP2蛋白。利用反向遗传技术拯救出嵌合犬细小病毒VP2基因的重组狂犬病毒,用灭活的重组抗原制备的疫苗免疫小鼠后产生较高的狂犬病毒和犬细小病毒的特异性抗体,并能抵抗狂犬病毒致死性攻击,为犬细小病毒和和狂犬病毒基因工程二联苗的研究奠定了基础。
【关键词】：狂犬病毒 犬细小病毒 反向遗传 VP2 免疫
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 英文缩略表13-14
• 第一章 引言14-24
• 1.1 狂犬病概述14-17
• 1.1.1 狂犬病14
• 1.1.2 狂犬病流行病学14
• 1.1.3 狂犬病临床症状与致病机理14-15
• 1.1.4 狂犬病毒基因组结构及编码蛋白15-16
• 1.1.5 狂犬病毒的生活周期16
• 1.1.6 狂犬疫苗研究进展16-17
• 1.2 犬细小病毒病概述17-19
• 1.2.1 犬细小病毒病17
• 1.2.2 犬细小病毒起源与演化17-18
• 1.2.3 犬细小病毒病的临床症状与致病机理18
• 1.2.4 犬细小病毒分类学和结构18-19
• 1.2.5 犬细小病毒疫苗研究进展19
• 1.3 负链RNA病毒的反向遗传操作和应用19-23
• 1.3.1 负链RNA病毒的反向遗传操作19-21
• 1.3.2 负链RNA病毒拯救过程的优化21
• 1.3.3 反向遗传技术在狂犬病毒中的应用21-23
• 1.4 目的与意义23-24
• 第二章 犬细小病毒VP2基因克隆分析及原核表达24-33
• 2.1 材料与方法24-27
• 2.1.1 病料24
• 2.1.2 主要试剂24-25
• 2.1.3 引物的设计与合成25
• 2.1.4 VP2基因的克隆与测序25-26
• 2.1.5 重组表达质粒的构建与鉴定26
• 2.1.6 VP2蛋白的原核表达及Western Blotting鉴定26
• 2.1.7 VP2蛋白切胶免疫豚鼠及豚鼠血清的免疫学鉴定26-27
• 2.2 结果与分析27-31
• 2.2.1 VP2基因的扩增以及序列分析27-28
• 2.2.2 VP2基因的系统进化树分析28-29
• 2.2.3 目的蛋白表达载体构建及鉴定结果29-30
• 2.2.4 VP2蛋白的表达和Western Blotting检测30-31
• 2.2.5 多克隆抗体的制备及免疫原性分析31
• 2.3 讨论31-33
• 第三章 重组病毒RBNSP-CPV-VP2的拯救及生物学特性研究33-40
• 3.1 材料与方法33-36
• 3.1.1 质粒、细胞33
• 3.1.2 主要试剂33-34
• 3.1.3 引物设计与合成34
• 3.1.4 PCR扩增犬细小病毒VP2基因34
• 3.1.5 表达VP2蛋白重组狂犬病毒基因组全长cDNA克隆的构建34
• 3.1.6 重组病毒的拯救34-35
• 3.1.7 免疫荧光鉴定重组病毒35
• 3.1.8 重组病毒的传代和毒价测定35
• 3.1.9 Western Blotting鉴定外源蛋白表达35
• 3.1.10 外源基因稳定性检测35-36
• 3.2 结果36-39
• 3.2.1 犬细小病毒VP2基因的扩增结果36
• 3.2.2 重组质粒双酶切鉴定结果36-37
• 3.2.3 免疫荧光鉴定重组病毒结果37
• 3.2.4 rBNSP-CPV-VP2毒价测定结果37-38
• 3.2.5 Western Blotting鉴定外源蛋白的表达结果38
• 3.2.6 外源基因稳定性检测结果38-39
• 3.3 讨论39-40
• 第四章 重组病毒对小鼠的免疫效果评价40-49
• 4.1 材料与方法40-43
• 4.1.1 实验动物、病毒40
• 4.1.2 主要试剂40
• 4.1.3 重组病毒对小鼠的毒力试验40-41
• 4.1.4 疫苗的制备与免疫41
• 4.1.5 狂犬病毒IgG抗体检测41
• 4.1.6 RFFIT检测狂犬病毒中和抗体41-42
• 4.1.7 间接ELISA方法检测VP2抗体42
• 4.1.8 ELISPOT检测细胞因子IL-4 和IFN-Γ42-43
• 4.1.9 攻毒保护试验43
• 4.1.10 数据分析43
• 4.2 结果43-47
• 4.2.1 重组病毒对小鼠的毒力检测结果43
• 4.2.2 狂犬病毒IgG抗体检测结果43-44
• 4.2.3 狂犬病毒中和抗体检测结果44-45
• 4.2.4 犬细小病毒抗体检测结果45-46
• 4.2.5 IL-4 和IFN-Γ 检测结果46-47
• 4.2.6 小鼠攻毒保护试验结果47
• 4.3 讨论47-49
• 第五章 全文结论49-50
• 参考文献50-57
• 致谢57-58
• 作者简历58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：988864