牛副流感病毒3型间接ELISA检测方法的建立与初步应用

发布时间：2017-10-08 01:08

  本文关键词：牛副流感病毒3型间接ELISA检测方法的建立与初步应用

  更多相关文章： 牛副流感病毒3型 NP-HN基因 原核表达 多克隆抗体 ELISA检测方法

【摘要】：牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)为单股负链有囊膜的RNA病毒,是引起牛呼吸道综合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)的重要病原之一,主要引起牛的上呼吸道感染,称为牛副流行性感冒(Parainfluenza bovum),以支气管炎、肺炎等呼吸道症状为主要特征,严重者甚至能引起流产,给养牛业带来了巨大的损失。目前国内针对BPIV3的研究尚处于起步阶段,还没有特别有效的BPIV3商品化检测试剂盒,鉴于BPIV3强大的传播能力和巨大的危害性,建立一种方便准确的BPIV3检测方法迫在眉睫。研究发现,BPIV3的NP蛋白是BPIV3中含量最高的蛋白之一,高度保守,其上存在3个主要抗原表位,有2个分布在C端。HN蛋白是表面抗原,在进化过程中高度保守。HN和NP蛋白,都具有很好的作为检测抗原的能力。将NP蛋白和HN蛋白抗原表位基因串联表达,作为检测抗原,在原理上可以放大检测效果。本实验根据BPIV3 SD2014株NP蛋白和HN蛋白的氨基酸序列,应用Lasergene软件分别对这两个蛋白的序列进行分析,同时查阅文献报道,最终确定NP蛋白的C端388aa~515aa,HN蛋白的C端355aa~572aa为优势抗原区。将选定的NP和HN蛋白抗原表位通过重叠延伸PCR方法串联(命名为NP-HN),构建pET28a(+)-NP-HN原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达该串联蛋白,将表达出的蛋白命名为NP-HN融合蛋白。以融合的NP-HN蛋白作为包被抗原,建立了BPIV3间接ELISA诊断方法。本实验具体研究内容及结果如下:1.通过重叠延伸PCR扩增技术,成功获得NP-HN截短串联基因,并将其连接至pET28a(+)载体,成功构建了原核重组表达载体pET-28a(+)-NP-HN。将该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)形成阳性转化子,经IPTG诱导,成功表达了大小为44kDa的NP-HN融合蛋白。2.利用Ni-NTA亲和层析方法纯化NP-HN融合蛋白,纯化后的融合蛋白经SDS-PAGE验证其有较高纯度。纯化后的蛋白经Western-blot检测,结果证明NP-HN融合蛋白能识别BPIV3阳性血清。利用Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒对纯化的NP-HN蛋白进行浓度测定,其蛋白浓度为900μg/ml。3.将纯化的NP-HN蛋白免疫3只新西兰白兔,制备了血清效价为1:32000的多克隆抗体。利用此多克隆抗体,分别对BPIV3、BVDV和IBRV全病毒进行ELISA检测,结果显示此多克隆抗体能与BPIV3发生反应,与BVDV和IBRV不发生反应,表明纯化的NP-HN蛋白具有良好的免疫反应性和免疫特异性。制备的多克隆抗体经western blot检测,结果显示全病毒的NP和HN蛋白能与多克隆抗体结合,这也间接说明融合蛋白NP-HN可以作为间接ELISA方法的检测抗原。4.BPIV3间接ELISA诊断方法的建立利用纯化后的NP-HN融合蛋白作为包被抗原,建立BPIV3间接ELISA检测方法。利用标准的阳性血清和阴性血清优化反应条件,确立最适反应条件:抗原包被浓度4μg/ml,37℃包被1h后4℃包被过夜;封闭液为20%马血清,37℃封闭1.5h;血清稀释度为1:50,37℃孵育1h;兔抗牛HRP稀释度为1:4000,37℃孵育1h;TMB显色液作用时间10min,1M H2SO4终止,用酶标仪测定OD450nm。确定该ELISA检测方法的判定标准为:将待测样品OD450nm≥0.30定为阳性,OD450nm0.30定为阴性。包被的重组融合蛋白NP-HN与牛病毒性腹泻粘膜病病毒和牛传染性鼻气管炎病毒无交叉反应,批间和批内重复性试验的变异系数小于8%。用所建立间接ELISA诊断方法与血清中和试验比较,总体总符合率为96.67%;与美国爱德士BPIV3间接ELISA试剂盒比较,总体符合率为95.56%。5.临本样本的检测利用所建立的BPIV3间接ELISA诊断方法对采自山东、辽宁和天津的3个奶牛场的270份临床血清样本进行检测,总的阳性率为82.59%,表明上述牛场存在BPIV3的感染与流行。
【关键词】：牛副流感病毒3型 NP-HN基因 原核表达 多克隆抗体 ELISA检测方法
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.653
【目录】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 引言12-21
• 1.1 研究目的与意义12-13
• 1.2 文献综述13-19
• 1.2.1 BPIV3病原学13-17
• 1.2.2 BPIV3流行病学17
• 1.2.3 BPIV3诊断17-19
• 1.3 研究内容19-20
• 1.4 技术路线20-21
• 2 材料与方法21-29
• 2.1 试验材料21
• 2.1.1 重组菌、病毒、血清及临床样品21
• 2.1.2 主要试剂21
• 2.1.3 主要仪器和设备21
• 2.2 试验方法21-29
• 2.2.1 抗原表位区域的筛选21-22
• 2.2.2 目的基因的克隆22-25
• 2.2.3 重组原核表达载体pET28a（+）-NP-HN的构建与鉴定25
• 2.2.4 融合蛋白NP-HN的诱导表达25-26
• 2.2.5 融合蛋白NP-HN可溶性分析26
• 2.2.6 融合蛋白NP-HN的纯化、鉴定及浓度测定26
• 2.2.7 多克隆抗体的制备与检测26-27
• 2.2.8 间接ELISA检测方法的建立与优化27-28
• 2.2.9 临床样品检测28-29
• 3 结果与分析29-41
• 3.1 抗原表位区的筛选29
• 3.2 NP-HN基因的PCR扩增29-30
• 3.3 克隆载体pEASY-T1-NP-HN酶切鉴定30-31
• 3.4 表达载体pET28a（+）-NP-HN的鉴定31
• 3.5 融合蛋白的诱导表达、可溶性分析及纯化31-32
• 3.6 融合蛋白NP-HN的鉴定32-33
• 3.7 多克隆抗体的制备与检测33-34
• 3.7.1 多克隆抗体效价测定33
• 3.7.2 多克隆抗体特异性的检测33
• 3.7.3 Western blot检测多克隆抗体33-34
• 3.8 间接ELISA工作条件的优化34-39
• 3.8.1 包被抗原及一抗的最佳稀释浓度34-35
• 3.8.2 抗原包被的最佳条件的确定35
• 3.8.3 最适封闭液及封闭时间的选择35-36
• 3.8.4 最佳二抗浓度的选择36
• 3.8.5 最佳显色时间的选择36-37
• 3.8.6 BPIV3间接ELISA判定标准37
• 3.8.7 特异性试验37-38
• 3.8.8 敏感性试验38
• 3.8.9 重复性试验38-39
• 3.8.10 符合率试验39
• 3.9 临床样品检测39-41
• 4 讨论41-44
• 4.1 目的基因的选择41
• 4.2 NP-HN融合蛋白的原核表达41-42
• 4.3 多克隆抗体的制备42
• 4.4 间接ELISA方法的建立42-44
• 5 结论44-45
• 致谢45-46
• 参考文献46-53
• 附录53-54
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文54

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王璋瑜;;蛋白设计实验室公司买下融合蛋白技术实用权[J];生物技术通报;1990年10期

2 张毅,屈贤铭,杨胜利;融合蛋白基因工程应用及研究[J];生物工程进展;2000年03期

3 杨林,李国清,黄葆英,王全忠,龙綮新,王s阏，

本文编号：991108