猪圆环病毒2型Rep蛋白多聚体形成的关键氨基酸位点研究

发布时间：2017-10-08 04:05

  本文关键词：猪圆环病毒2型Rep蛋白多聚体形成的关键氨基酸位点研究

  更多相关文章： 猪圆环病毒(PCV) Rep 多聚化 复制率 海肾荧光素酶活性 解旋酶活性

【摘要】：猪圆环病毒(PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae),圆环病毒属(Circovirus),是已知最小的动物病毒。其于20世纪70年代在培养的PK-15细胞中被发现,随后在加拿大大量爆发称为断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的猪体内检测到了PCV。后将具有致病性的PCV命名为PCV2,而将无致病力的PCV命名为PCV1。目前PCV2感染已经蔓延至世界各地养猪场,给世界各国养猪业带来巨大的经济损失。现阶段对于PCV2复制相关蛋白Rep参与病毒滚环复制的机制研究还不够深入,比如Rep蛋白是否以多聚体形式行使在滚环复制中的功能、Rep蛋白间相互作用的关键性位点等许多关键性问题还未阐释清楚。因此探究Rep蛋白间相互作用的关键位点以及解析Rep全长蛋白的空间结构能够为发现PCV Rep蛋白新的功能结构域、进一步阐释滚环复制机制从而开发针对PCV2高效疫苗和治疗新药物奠定更为扎实的基础。根据本实验室前期研究结果,推测Rep蛋白第107位半胱氨酸、第35位亮氨酸及第37位异亮氨酸可能对Rep蛋白二聚体的形成具有关键作用。本研究通过突变Rep蛋白第107位半胱氨酸、第35位亮氨酸以及第37位异亮氨酸在真核及原核表达系统中检测突变体对蛋白多聚化的影响,在PCV2复制子上验证突变对复制子复制率、海肾荧光素酶活性的影响以及突变对蛋白解旋酶活性的影响,并尝试对Rep全长蛋白进行晶体的初步筛选。研究的内容及结果如下:(1)PCV2 Rep融合蛋白的表达纯化以及融合标签的切除将扩增出的PCV2 Rep基因连接至pET28a-SUMO原核表达载体后转化至BL21(DE3)感受态细胞经诱导表达,利用Ni2+亲和层析成功纯化出SUMO-Rep融合蛋白。将纯化出的SUMO-Rep融合蛋白用SUMO蛋白酶于4℃条件切割2 h能够完全去除SUMO标签。(2)Rep全长蛋白及其突变体的多聚化检测成功构建pcDNA3.1-Rep、pcDNA3.1-Rep-C107A、pcDNA3.1-Rep-L35A-I37AC107A真核表达质粒并转染293T细胞进行非还原SDS-PAGE,结果表明在非还原变性条件下真核表达的野生型及突变体蛋白均未见二聚体及更高聚体形式而仅见蛋白单体形式。将原核表达纯化后去除SUMO标签的野生型以及C107A、L35A-I37A-C107A突变体Rep蛋白用分子筛验证蛋白多聚化。结果表明PCV2 Rep全长蛋白C107A突变体的多聚化与野生型蛋白相似,而L35A-I37A-C107A突变体蛋白的多聚化受到影响。说明第107位半胱氨酸并不是Rep全长蛋白形成分子间二硫键从而形成多聚体的关键性位点,而第35位亮氨酸、第37位异亮氨酸参与了Rep全长蛋白间的相互作用。(3)基于Rep基因复制子突变体的构建以及复制子复制率、海肾荧光素酶活性的检测根据本实验室构建PCV2复制子的流程,成功构建Rep基因C107A以及L35AI37A-C107A复制子突变体。将复制子突变体转染PK-15细胞后采用Realtime-PCR方法检测复制子复制率,用Renilla Luciferase Assay System试剂盒检测海肾荧光素酶活性。结果表明C107A突变体复制子的复制率及海肾荧光素酶活性较野生型复制子高,而L35A-I37A-C107A突变体复制子复制率及海肾荧光素酶活性较野生型严重降低,与非复制子的复制率及海肾荧光素酶活性相当。(4)Rep全长蛋白突变体解旋酶活性的检测通过非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳检测Rep全长蛋白及其突变体解旋酶活性。结果表明C107A突变体蛋白以及L35A-I37A-C107A突变体蛋白的解旋酶活性与野生型Rep蛋白的解旋酶活性相比并无明显差异。(5)PCV2 Rep全长蛋白晶体的初步筛选将切除SUMO标签的Rep蛋白通过分子筛进一步纯化并浓缩后,采用座滴扩散的方法对实验室保存的5个晶体筛选试剂盒共480种条件进行了初步筛选。但遗憾的是经过尝试各种条件仍无法生长出蛋白晶体。
【关键词】：猪圆环病毒(PCV) Rep 多聚化 复制率 海肾荧光素酶活性 解旋酶活性
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.651
【目录】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 缩略语表（ABBREVIATION）11-12
• 第1章 文献综述12-22
• 1.1 猪圆环病毒概述12-14
• 1.2 猪圆环病毒的基因组结构及其理化特性14-15
• 1.3 猪圆环病毒的转录产物15
• 1.4 猪圆环病毒编码的开放阅读框（ORF）15-19
• 1.5 滚环复制过程机制19-20
• 1.6 其他病毒Rep蛋白多聚体研究进展20-22
• 第2章 研究目的与意义22-23
• 第3章 材料与方法23-43
• 3.1 实验材料23-27
• 3.1.1 菌种、质粒和细胞23
• 3.1.2 主要药品及试剂（盒）23-24
• 3.1.3 主要培养基及抗生素和诱导剂的配制24
• 3.1.4 缓冲液24-26
• 3.1.4.1 50×TAE缓冲液24
• 3.1.4.2 0.8%琼脂糖凝胶24
• 3.1.4.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）缓冲液24-25
• 3.1.4.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）缓冲液25
• 3.1.4.5 蛋白纯化缓冲液及其他相关缓冲液25-26
• 3.1.4.6 Western-blot缓冲液的配制26
• 3.1.4.7 解旋反应相关缓冲液的配制26
• 3.1.5 引物设计26-27
• 3.1.6 荧光底物27
• 3.2 实验方法27-43
• 3.2.1 目的基因的扩增27
• 3.2.2 目的片段的回收27-28
• 3.2.3 目的片段的连接28
• 3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备28-29
• 3.2.5 连接产物的转化29
• 3.2.6 质粒的提取与酶切鉴定29-32
• 3.2.6.1 质粒的少量提取29-30
• 3.2.6.2 质粒的大量提取30-32
• 3.2.6.3 质粒的酶切鉴定32
• 3.2.7 表达质粒的构建与鉴定32-33
• 3.2.7.1 质粒的双酶切与回收32
• 3.2.7.2 目的片段与表达载体的连接与转化32-33
• 3.2.7.3 重组质粒的提取与酶切鉴定33
• 3.2.7.4 重组表达菌株的构建33
• 3.2.8 重组菌的表达与鉴定33-36
• 3.2.8.1 重组蛋白在E.coli中可溶性表达33-34
• 3.2.8.2 SDS-PAGE检测34
• 3.2.8.3 Western blot鉴定34-35
• 3.2.8.4 重组蛋白的表达35
• 3.2.8.5 可溶性蛋白的纯化及鉴定35-36
• 3.2.9 BCA法测定蛋白浓度36-37
• 3.2.10 利用凝胶过滤层析（分子筛）纯化蛋白质37-38
• 3.2.11 Rep蛋白解旋酶活性的测定38
• 3.2.12 细胞的复苏、传代、冻存38-39
• 3.2.12.1 细胞的复苏38
• 3.2.12.2 细胞的传代38-39
• 3.2.12.3 细胞的冻存39
• 3.2.13 细胞转染39
• 3.2.14 海肾荧光素酶活性检测39-40
• 3.2.15 细胞总DNA的提取40-41
• 3.2.16 荧光定量PCR41
• 3.2.17 间接免疫荧光（IFA）41-42
• 3.2.18 蛋白质结晶条件的筛选42-43
• 第4章 结果与分析43-61
• 4.1 PCV2 Rep基因的扩增43
• 4.2 重组质粒pET28a-SUMO-Rep的双酶切鉴定43-44
• 4.3 SUMO-Rep融合蛋白的纯化及Western blot验证44-45
• 4.4 SUMO-Rep融合蛋白SUMO标签的去除及Rep蛋白的纯化45-47
• 4.5 Rep蛋白突变体对蛋白多聚化的影响47-52
• 4.5.1 Rep突变体真核及原核表达质粒的构建47-49
• 4.5.2 Rep蛋白突变体在真核细胞中对蛋白多聚化的影响49-50
• 4.5.3 Rep蛋白突变体对原核表达的蛋白多聚化的影响50-52
• 4.6 Rep突变体对复制子复制的影响52-58
• 4.6.1 PCV2复制子突变体的构建52-57
• 4.6.1.1 含有 2A序列的Rep基因突变体的构建52-54
• 4.6.1.2 pcDNA3.1-Rluc-Rep突变体质粒的构建54-55
• 4.6.1.3 ori-PCMV-Rluc-Rep突变体片段的扩增55-56
• 4.6.1.4 pT-ori-ORF1复制子突变体的构建56-57
• 4.6.2 Rep突变体对复制子复制率的影响57-58
• 4.6.3 Rep突变体对复制子海肾荧光素酶活性的影响58
• 4.7 Rep突变体对蛋白解旋酶活性的影响58-60
• 4.8 Rep蛋白晶体的初步筛选60-61
• 第5章 讨论与结论61-64
• 5.1 讨论61-63
• 5.2 结论63-64
• 参考文献64-75
• 致谢75

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