高原甘加型藏羊发情周期垂体FSH和LH细胞的表达及其激素分泌的动态变化研究

发布时间：2017-10-08 08:02

  本文关键词：高原甘加型藏羊发情周期垂体FSH和LH细胞的表达及其激素分泌的动态变化研究

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【摘要】：研究表明动物的生殖活动主要受下丘脑-垂体-性腺轴(Hypothalamic-pituitar y-gonadal axis,HPGA)的调控,而垂体作为动物繁殖重要的内分泌腺,其垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的促性腺激素对哺乳动物的性发育、性成熟、性周期等生理特点起着重要的主导因素。其中卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,FSH)和促黄体激素(Luteinizing hormone,LH)直接参与调控母畜的发情、排卵等生殖过程。因此,研究藏羊垂体组织FSH和LH细胞的形态与表达,对藏羊生殖活动具有重要意义和应用价值。为了阐明高原甘加型藏羊发情周期腺垂体FSH和LH细胞的表达及其激素分泌的动态变化在生殖活动中的作用。本研究(1)对甘加臧羊发情周期不同阶段的垂体组织促卵泡素和促黄体素细胞的分布及其基因mRNA表达和变化规律进行了研究;(2)对发情周期不同阶段垂体中促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)分泌的动态变化规律进行了研究,并观察了乏情期垂体FSH和LH变化。在繁殖季节选取年龄2.5~3.5岁,发育正常的健康未孕雌性高原甘加型藏羊32只,作为发情周期组,并按发情周期的不同阶段分为4组:发情前期、发情期、发情后期、间情期。在非繁殖季节选取8只年龄2.5-3.5岁,健康未孕的雌性甘加羊作为乏情期组。采集甘加藏羊发情周期不同阶段和乏情期的垂体组织,应用(1)HE染色观察各组甘加藏羊垂体细胞形态分布特征;(2)应用免疫组织化学SP法分别对各组藏羊垂体组织中FSH和LH细胞的分布表达变化进行研究,并应用Image pro-plus图像分析垂体组织中FSH和LH免疫反应阳性产物的光密度表达量;(3)应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术,对各组藏羊垂体组织中FSHβ和LHβ基因在mRNA水平的动态表达差异进行研究(4)应用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组藏羊腺垂体中FSH和LH的含量,分析其在发情周期的动态变化规律。研究结果如下:1.HE染色结果显示:高原甘加型藏羊发情周期内腺垂体嗜酸性细胞体积较大,圆形或椭圆形,胞质嗜酸性着色,核圆形,着色较深;嗜碱性细胞体积最大,圆形或多边形,胞质嗜碱性着色,核圆形,着色较浅;嫌色细胞体积最小,胞质着色很浅,细胞界限不清,核圆形或不规则形,着色较浅的。并且在发情周期内三种细胞的生理活动都有所变化。嗜酸性细胞在发情周期和乏情期分泌颗粒和胞质着色较稳定;嗜碱性细胞在发情前期、发情期、发情后期分泌颗粒和胞质着色数量逐渐增多,在间情期和乏情期降低:淡染的嫌色细胞几乎没有胞质颗粒,但在发情周期内数量变化明显,并在间情期和乏情期数量较多。2.免疫组织化学结果显示:甘加型藏羊发情周期FSH和LH免疫反应阳性细胞主要分布在垂体的远侧部,中间部很少;发情期FSH和LH阳性细胞较少,细胞形态不规则,胞浆淡染;发情后期和间情期数量增多,细胞为大中型,形态多角型或卵圆形,胞浆浓染,且间情期LH阳性细胞数达到最大;发情前期FSH数量增加达到最大,细胞大,圆形或卵圆形,胞浆浓染;FSH阳性细胞胞浆比LH细胞浓染。FSH和LH阳性反应细胞占垂体中数量的百分比(发情期、发情后期、间情期、发清前期):FSH为9.78%,11.37%,12.81%,13.05%;LH为8.72%,12.73%,14.25%,13.72%,且各时期二者均差异不显著(p0.05)。3.IPP图像测算平均光密度显示:FSH表达量在发情期较低,发情后期有所增加,间情期和发情前期达到最大而与其他时期差异显著(P0.05);LH表达量在发情期较低,发情后期、间情期和发情前期均增加且差异不显著(p0.05)。LH表达量除在发情期低于FSH外,其他时期均高于FSH。4.实时荧光定量PCR显示:FSHβ和LHβmRNA在发情周期不同阶段甘加型藏羊垂体中均有表达。FSHβmRNA相对表达量(发清前期、发情期、发情后期、间情期)为0.2359±0.017、1±0.2805、3.5475±0.8017、3.6667±1.4492,发清前期与发情期、发情后期和间情期差异极显著(p0.01),发情期与发情后期和间情期差异显著(p0.05),发情后期与间情期差异不显著(p0.05);LHβmRNA相对表达量为0.0259±0.0038、1±0.6318、16.1091±3.2674、0.5638±0.1962,发情前期与发情期、发情后期和间情期差异极显著(p0.01),发情期与发情后期差异极显著(p0.01),与间情期差异不显著(p0.05),发情后期与间情期差异极显著(p0.01)。5.酶联免疫吸附试验显示:甘加藏羊发情周期内腺垂体FSH浓度在间情期最大(8.228mIU/ml),与其他时期差异显著(P0.05);腺垂体LH浓度在间情期最大(10.629mIU/ml),各时期差异不显著(P0.05);
【关键词】：甘加型藏羊 发情周期 垂体 促卵泡素 促黄体素 酶联免疫分析法 免疫组织化学 实时荧光定量PCR
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S826
【目录】：

• 摘要5-7
• SUMMARY7-12
• 第一部分：研究背景和研究的意义12-23
• 1.研究背景12-21
• 1.1 藏羊的品种及特性12
• 1.2 下丘脑-垂体-性腺轴调节机制的研究12-13
• 1.3 促性腺激素分泌规律的研究13-16
• 1.4.促性腺激素细胞的研究进展16-17
• 1.5 生殖激素在动物繁殖技术中的应用17
• 1.6 雌性动物的生殖周期特点17-19
• 1.7 下丘脑垂体卵巢轴的季节性变化19
• 1.8 酶联免疫吸附试验（ELISA）技术19-21
• 2.研究的意义21-23
• 第二部分：甘加型藏羊发情周期垂体组织中FSH和LH细胞的表达研究23-44
• 1.材料和方法23-29
• 1.1 试验材料23-24
• 1.2 试验方法24-29
• 1.2.1 发情判定和分组24-25
• 1.2.2 石蜡包埋步骤25-26
• 1.2.3 HE染色方法26
• 1.2.4 免疫组织化学26-27
• 1.2.5 对照试验27
• 1.2.6 甘加型藏羊垂体组织总RNA提取及反转录27-28
• 1.2.7 引物的设计与合成28
• 1.2.8 qRT-PCR28
• 1.2.9 FSH和LH阳性细胞形态观察和细胞数量统计28
• 1.2.10 数据处理28-29
• 2 结果与分析29-38
• 2.1 甘加型藏羊发情周期垂体HE染色观片结果29-30
• 2.2 甘加型藏羊垂体组织FSH免疫阳性细胞分布和表达30-31
• 2.3 甘加型藏羊垂体组织LH免疫阳性细胞分布和表达31-35
• 2.4 甘加型藏羊发情周期不同阶段垂体组织中FSHβ 和LHβmRNA的差异表达35-38
• 3 讨论38-42
• 3.1 甘加型藏羊垂体的结构特点38-39
• 3.2 甘加型藏羊发情周期垂体组织FSH和LH细胞的分布类型39
• 3.3 甘加型藏羊发情周期垂体组织FSH和LH细胞形态及数量的变化规律39-40
• 3.4 甘加型藏羊发情周期腺垂体FSH和LH的相互关系40-41
• 3.5 甘加型藏羊垂体中FSHβ mRNA和LHβ mRNA表达规律特点41-42
• 3.6 垂体FSH和LH免疫阳性细胞数目和垂体FSH和LH含量及血浆中FSH和LH之间的关系42
• 4 小结42-44
• 第三部分：甘加型藏羊发情周期腺垂体和血浆中FSH和LH分泌规律的研究44-56
• 1.材料和方法44-47
• 1.1 试验材料与仪器44-45
• 1.2 试验方法45-47
• 1.2.1 血样的采集与处理45
• 1.2.2 血样的制备方法45
• 1.2.3 垂体的采集方法45
• 1.2.4 腺垂体组织液制备方法45-46
• 1.2.5 腺垂体组织和血浆FSH和LH的测定46
• 1.2.6 数据处理46-47
• 2 结果47-51
• 2.1 甘加藏羊发情周期腺垂体中FSH的分泌变化47
• 2.2 甘加藏羊发情周期血浆中FSH的分泌变化47-48
• 2.3 甘加藏羊发情周期腺垂体中LH的分泌变化48
• 2.4 甘加藏羊发情周期血浆中LH的分泌变化48-50
• 2.5 甘加藏羊发情周期腺垂体和血浆中FSH和LH之间的的分泌比较50
• 2.6 甘加藏羊发情周期与乏情期腺垂体和血浆中FSH和LH含量的比较50-51
• 3 讨论51-54
• 3.1 甘加藏羊发情周期腺垂体和血浆中FSH和LH含量及其分泌变化规律51-52
• 3.2 甘加藏羊腺垂体和血浆中FSH和LH之间的的分泌比较分泌调节52-53
• 3.3 甘加藏羊发情周期和乏情期FSH和LH变化特点53-54
• 3.4 甘加型藏羊发情周期内FSH和LH分泌峰值的变化特点54
• 4 小结54-56
• 全文结论56-57
• 参考文献57-66
• 致谢66-67
• 作者简介67-68
• 导师简介68-70

【参考文献】

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本文编号：992867