猪戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法的建立及盐城地区流行病学调查

发布时间：2017-10-09 10:49

  本文关键词：猪戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法的建立及盐城地区流行病学调查

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【摘要】：戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)感染引发的一种急性的病毒性传染病。HEV主要在发展中国家流行,在发达国家呈散发性流行,在我国感染率较高。市场上用于治疗戊型肝炎的药物很少,现在对于HEV的防治,主要以预防及切断传播途径为主。1.为建立猪戊型肝炎病毒(Swine Hepatitis E virus,SHEV)的TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究根据SHEV基因ORF2保守区设计引物及探针,并对PCR反应条件进行优化。结果表明,该方法相关系数可达0.999,102拷贝/μL~109拷贝/μL内具有良好的线性关系。对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和伪狂犬病毒的RNA或DNA进行检测,结果均为阴性。该方法可检出最低拷贝数为101拷贝/μL。重复性试验结果表明该方法的批内和批间变异系数均小于等于3.0%。本研究使用荧光定量PCR对黑龙江省临床收集的131份样品(肝脏45份、粪便86份)进行检测,总阳性率为11.45%,其中肝脏阳性率为22.22%,粪便阳性率为5.81%。该方法的建立为SHEV的快速检出及绝对定量奠定了良好的基础。2.为了解盐城地区猪群感染SHEV的情况,在江苏省盐城地区10家猪场采集了747份猪粪便样品进行检测。采用套式RT-PCR的方法对目的片段进行扩增,通过测序及比对分析。研究结果表明,10家猪场均存在SHEV感染,感染率因猪场及生长阶段而异,感染率分布在2%~28%。试验共检出阳性样品86份,可测序样品81份。对测序结果进行比对分析,构建系统进化树,进行同源进化分析。系统进化分析结果表明,有73份为SHEV基因Ⅳ型,8份属于SHEV基因Ⅲ型。
【关键词】：猪戊型肝炎病毒 荧光定量PCR TaqMan探针 流行病学
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S855.3
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 文献综述9-27
• 1.1 戊型肝炎病毒9-14
• 1.1.1 戊型肝炎病毒病原学9-10
• 1.1.2 戊型肝炎病毒基因组结构10
• 1.1.3 戊型肝炎病毒蛋白10-12
• 1.1.4 戊型肝炎病毒基因型及分布12-13
• 1.1.5 戊型肝炎病毒的复制13-14
• 1.1.6 戊型肝炎病毒的培养系统14
• 1.2 戊型肝炎病毒致病机制14-16
• 1.2.1 致病机制14-15
• 1.2.2 动物模型在致病机制中的研究15-16
• 1.3 戊型肝炎病毒的传播及临床表现16-18
• 1.3.1 传播途径16-17
• 1.3.2 可能的动物传染源17-18
• 1.3.3 临床表现18
• 1.4 猪戊型肝炎病毒的诊断18-21
• 1.4.1 酶联免疫吸附试验19
• 1.4.2 聚合酶链式反应19-20
• 1.4.3 血清中和试验20
• 1.4.4 免疫荧光20
• 1.4.5 免疫电镜法20
• 1.4.6 荧光定量PCR20-21
• 1.5 戊型肝炎病毒的流行病学21-22
• 1.6 治疗和控制策略22-24
• 1.7 未来展望24
• 1.8 研究目的及意义24-27
• 第二章 猪戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法的建立27-37
• 2.1 材料27-28
• 2.1.1 克隆载体及菌种27
• 2.1.2 病毒株27
• 2.1.3 肝脏及粪便样品27
• 2.1.4 主要试剂与仪器27-28
• 2.2 方法28-32
• 2.2.1 引物与探针的设计28-29
• 2.2.2 病毒RNA的提取及cDNA的合成29
• 2.2.3 标准品的制备29-31
• 2.2.4 反应条件的优化31
• 2.2.5 标准曲线的建立31
• 2.2.6 特异性试验31
• 2.2.7 敏感性试验31
• 2.2.8 重复性试验31-32
• 2.2.9 临床样品检测32
• 2.3 结果32-37
• 2.3.1 标准品的制备32-33
• 2.3.2 荧光定量PCR方法的建立33
• 2.3.3 标准曲线的建立33-34
• 2.3.4 特异性试验结果34
• 2.3.5 敏感性试验结果34-35
• 2.3.6 重复性试验结果35
• 2.3.7 临床检测35-37
• 第三章 盐城地区猪戊型肝炎病毒流行病学调查37-43
• 3.1 材料37
• 3.1.1 样品37
• 3.1.2 主要试剂与仪器37
• 3.1.3 引物37
• 3.2 方法37-39
• 3.2.1 粪便样品病毒RNA的提取37-38
• 3.2.2 套式PCR反应38
• 3.2.3 鉴定及回收纯化38-39
• 3.2.4 统计分析39
• 3.3 结果39-43
• 3.3.1 盐城地区猪戊型肝炎病毒流行情况39-40
• 3.3.2 测序结果40-41
• 3.3.3 进化树分析41-42
• 3.3.4 同源性分析42-43
• 第四章 讨论43-45
• 第五章 结论45-47
• 参考文献47-59
• 致谢59-61
• 附录61-63
• 作者简历63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：999760