氯化钴在BMSCs修复HIBD认知功能中的作用

发布时间：2017-12-10 06:04

  本文关键词：氯化钴在BMSCs修复HIBD认知功能中的作用

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【摘要】：第一部分建立CoCl_2激活BMSCs的HIF-1信号系统的最佳药物浓度及HIF-1抑制剂2-ME2在BMSCs分泌效应中的作用 目的建立氯化钴（CoCl_2）药物浓度水平与BMSCs的HIF-1蛋白水平、增殖指标MTS以及损伤指标LDH水平的效应曲线。以VEGF、EPO、IGF-1蛋白水平为效应指标，论证HIF-1稳定剂及HIF-1抑制剂2-ME2在BMSCs分泌效应中的作用，并确定BMSCs分泌蛋白的时间剂量曲线。寻求CoCl_2激活BMSCs的HIF-1a信号系统的最佳药物浓度。1 方法分离培养BMSCs并用0、10、25、50、100M CoCl_2干预12h、24h、36h、48h后采用LDH检测BMSCs毒性和MTS检测BMSCs增殖情况；采用ELISA检测CoCl_2及HIF-1抑制剂2-ME2在BMSCs分泌VEGF、EPO、IGF-1中的作用；采用westernblot检测25M CoCl_2干预BMSCs6h、12h、24h、36h后HIF-1蛋白的表达趋势。 结果（1）LDH检测结果显示不同药物浓度的CoCl_2在0-48h之间对细胞毒性影响无统计学意义(p0.05)。（2）MTS检测结果显示不同药物浓度的CoCl_2在0-48h之间对细胞增殖的影响无统计学意义(p0.05)。（3）CoCl_2作用BMSCs后，分泌蛋白的时间剂量效应关系：10M CoCl_2在48h内不能有效促进BMSCs分泌VEGF，25MCoCl_2在36h内随着作用时间的增加VEGF表达也增多，36h表达量最多；在12h时，随着剂量的增加EPO蛋白表达增加，100M达到最大；各药物浓度在作用BMSCs12h、36h、48h后，IGF-1蛋白的表达与对照组比较无明显的差异（p0.05）。（4）CoCl_2作用BMSCs后，westernblot检测HIF-1蛋白表达的时间效应，36h HIF-1蛋白表达比其它各组都多（p0.05）。（5）CoCl_2促进BMSCs分泌生长因子的效应可被HIF-1抑制剂抑制。25M CoCl_2培养液中加入1M、2.5M、5M2-ME2后VEGF、EPO、IGF-1表达都明显降低（p0.01），且在2.5M2-ME2作用下VEGF、EPO、IGF-1表达最低。 结论（1）（0-100uM）CoCl_2作用BMSCs12h、24h、36h、48h后对细胞没有明显的毒性作用。（2）（0-100uM）CoCl_2对BMSC作用12h、24h、36h、48h后对细胞增殖没有明显的影响。（3）CoCl_2能促进BMSCs分泌生长因子，25M CoCl_2作用BMSCs36h为促进VEGF、EPO、IGF-1蛋白表达的最适条件。（4）2-ME2可抑制CoCl_2促进BMSCs分泌生长因子的作用，2.5M2-ME2为抑制25M CoCl_2作用BMSCs36h条件下VEGF和EPO表达的最适浓度。 第二部分探讨BMSCs条件培养基改善HIBD大鼠认知功能中的作用 目的建立新生大鼠培养基持续脑室内灌注的技术手段以及探讨BMSCs条件培养基改善HIBD大鼠认知功能中的作用。 方法生后7日龄HIBD大鼠40只。随机分为培养基对照组（DMEM组，n=8)、骨髓间充质干细胞培养上清液组（BMSCs-DMEM组，n=8）、CoCl_2作用骨髓间充质干细胞后的培养基上清液组（CoCl_2-DMEM组，n=8）、CoCl_2作用下的骨髓间充质干细胞以及培养基上清液组（CoCl_2-DMEM+BMSCs组，n=8）、CoCl_2和2-ME2共同作用骨髓间充质干细胞后的培养基上清液组（CoCl_2+2-ME2-DMEM组，n=8）。收集浓缩相应的培养基并通过Alzet微型真空泵的方式连续7天注入10日龄HIBD大鼠左侧脑室。大鼠生后7周行Morris水迷宫观察CoCl_2对大鼠空间学习记忆能力的影响;大鼠生后8周通过HE、尼氏染色对各组进行病理学观察； ELISA定量检测脑组织VEGF、EPO、IGF-1水平；采用神经电生理技术检测各组HIBD大鼠海马脑片LTP诱发；免疫荧光检测各组HIBD大鼠的突触可塑性关键指标AMPA受体(a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxa-zolep-propionatereceptor, AMPAR)的GluR2亚基的表达情况。 结果（1）各组HIBD大鼠在持续7天脑室内灌注条件培养基后的一般情况：摄食、睡眠情况良好，毛发光亮，行为活动无异常，精神可。（2）水迷宫行为学测试观察条件培养基对HIBD大鼠认知功能的作用：CoCl_2-DMEM组和CoCl_2-DMEM+BMSCs组与DMEM组比较,平均潜伏期均明显缩短，穿越平台区域的时间增加，空间学习记忆能力部分恢复(P 0.01)。（3）组织病理学HE染色以及尼氏染色观察发现DMEM组和BMSCs-DMEM组较CoCl_2-DMEM组大鼠海马区结构紊乱，神经细胞损伤严重。 CoCl_2-DMEM组异常细胞数较CoCl_2+BMSCs-DMEM组多(P 0.01)。（4）采用ELISA探讨脑组织中生长因子的分泌情况，，CoCl_2-DMEM组VEGF、IGF-1表达较DMEM组和BMSCs-DMEM组高（p 0.01）。CoCl_2-DMEM+BMSCs组较CoCl_2-DMEM组高（p 0.01），在2-ME2作用下，脑组织中VEGF、IGF-1表达都降低。（5）CoCl_2处理能增加LTP诱发率。CoCl_2-DMEM组较DMEM组和BMSCs-DMEM组诱发率增高，CoCl_2-DMEM+BMSCs组最高。（6）通过GluR2免疫荧光探讨LTP分子机制。荧光显微镜下观察发现DMEM组和BMSCs-DMEM组大鼠海马区GluR2表达较CoCl_2-DMEM组和CoCl_2+BMSCs-DMEM组少(P0.01)。CoCl_2+BMSCs-DMEM组较CoCl_2-DMEM组GluR2表达多(P0.01)。CoCl_2+2-ME2-DMEM组比CoCl_2-DMEM组少(P 0.01)。 结论(1) CoCl_2能有效改善HIBD的空间学习记忆能力，2-ME2能抑制其发挥此作用。（2） CoCl_2作用的条件培养基与BMSCs可更好促进HIBD大鼠海马区结构和神经细胞损伤后的修复，二者发挥协同作用。（3）CoCl_2可以促进HIBD大鼠脑组织分泌VEGF、IGF-1等神经营养因子发挥功能修复作用。（4）CoCl_2处理能增加LTP诱发率。（5）从分子机制上验证CoCl_2处理能调节海马突触可塑性。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R722.1

【共引文献】

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本文编号：1273383