miR-455-5p调控STRA6在Nitrofen诱导的先天性膈疝肺发育不良的机制研究
本文关键词： miR-455-5p 维A酸信号通路 STRA6 先天性膈疝肺发育不良 出处：《南方医科大学》2017年博士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：目的:研究miR-455-5p调控维A酸信号通路膜受体STRA6在Nitrofen诱导的CDH发育不良的机制,阐明miR-455-5p～STRA6～CDH肺发育不良三者之间联系,揭示CDH肺发育不良的发生机制,探讨CDH病因,为预防CDH肺发育不良的发生及探索新的产前干预方法提供理论依据和实验基础。方法:1.利用生物信息学软件对STRA6基因上游mircroRNAs进行预测。2.应用双荧光素酶报告基因技术验证miR-455-5p调控STRA6基因。3.建立Nitrofen诱导的先天性膈疝肺发育不良模型;QPCR检测第15.5天miR-455-5p、STRA6mRNA在胎鼠肺中的表达变化;ELISA检测胎鼠肺中维生素A的浓度变化。4.免疫组织化学及免疫荧光组织化学方法检测胎鼠肺STRA6蛋白的表达。5.构建miR-455-5p过表达腺病毒,转染大鼠肺上皮细胞;Western Blotting检测STRA6的蛋白表达水平变化;ELISA检测细胞维生素A浓度的变化;CCK8检测细胞增殖功能的变化。结果:1.利用生物信息学软件预测上游mircroRNAs的结果三个软件共同预测表明STRA6基因上游的mircroRNA为miR-455-5p。2.双荧光素酶报告基因的实验结果根据双荧光素酶报告基因表达分析结果显示:STRA6-WT+NC、STRA6-WT+miR-455-5p、STRA6-Mut+NC、STRA6-Mut+miR-455-5p 的平均相对荧光值分别为:1.000±0.023、0.521±0.025、1.000±0.014、0.768±0.008;miR-455-5p-5p mimic对STRA6野生型的报告荧光下调47.9%(30%),对其预测靶位点进行突变后,突变型载体中的报告荧光有所恢复,但仍下调23.2%;miR-455-5p可以调控STRA6基因的表达。3.动物模型的结果及QPCR检测miR-455-5p、STRA6mRNA表达量,ELISA检测胎鼠肺中维生素A的浓度变化的实验结果Nitrofen诱导先天性膈疝肺发育不良大鼠模型的结果:6只对照组孕鼠于15.5天剖宫产得62只胎鼠肺样本,6只Nitrofen诱导组孕鼠得到胎鼠45只,将各只孕鼠的胎鼠取出肺部,平均分配于各种实验方法;在第15.5天,Nitrofen诱导组和对照组miR-455-5p相对表达量分别为29.450±9.253、5.955±2.330,两组相比,Nitrofen诱导组表达量明显上升,有统计学意义(P0.05);Nitrofen诱导组和对照组STRA6 mRNA相对表达量分别为:0.197±0.097、0.588±0.184,两组相比,Nitrofen诱导组表达量明显下降,有统计学意义(P0.05);Nitrofen组和对照组维生素A平均浓度(ug/ml)分别为:4.013±0.195、5.317±0.337,Nitrofen组维生素A浓度明显下降,两组相比有统计学意义(P=0.0000.05)。4.免疫组织化学及免疫荧光组织化学实验结果免疫组织化学:Nitrofen诱导组和对照组STRA6蛋白平均H-SCORE值分别为120.020±8.514、156.242±9.922,Nitrofen诱导组STRA6蛋白相对表达量明显降低,两组相比有统计学意义(P0.05)。免疫荧光组织化学:Nitrofen诱导组和对照组STRA6蛋白的平均IOD值分别为805.643±291.182、1616.391±572.308,两组相比,Nitrofen诱导组相对表达量明显降低,有统计学意义(P0.05)。5.miR-455-5p在大鼠肺上皮细胞过表达后对其靶基因STRA6、细胞维生素A浓度和细胞增殖功能影响的实验结果Western Blotting实验结果:miR-455-5p过表达组和N C组STRA6蛋白的相对表达量分别为:0.615±0.131、0.958±0.246,miR-455-5p过表达组的STRA6蛋白的相对表达量明显下降,两组相比有统计学意义(P0.05)。ELISA检测细胞维生素A浓度结果:miR-455-5p过表达组和N C组细胞维生素 A平均浓度(ug/ml)分别为:2.985±0.061、3.949±0.118,miR-455-5p 过表达组的细胞维生素A浓度明显下降,两组相比有统计学意义(P0.05)。CCK8实验结果:在24h、48h、72h、96h时,miR-455-5p过表达组和NC组平均光密度值分别为 0.280±0.184 和 1.354±0.169,0.881±0.016,和 1.992±0.050,2.937±0.079 和 2.105±0.148,4.955±0.021 和 3.315±0.043.在4个时间点,miR-455-5p过表达组平均光密度值明显减少,两组相比均有统计学意义(P0.05);两组内各个时间点相比有统计学意义(P0.05),两组平均光密度值呈上升趋势。结论:在Nitrofen诱导的先天性膈疝肺发育不良模型中,miR-455-5p的表达异常升高,导致靶基因STRA6mRNA部分降解,STRA6蛋白表达下降,维生素A转运障碍,引起肺组织维生素A浓度下降。在大鼠肺上皮细胞中,miR-455-5p过表达后,细胞中STRA6的蛋白表达量下降,维生素A转运障碍,使细胞维生素A浓度下降,从而影响细胞增殖。结合上述实验结果:我们认为miR-455-5p的异常升高是先天性膈疝肺发育不良的原因之一。
[Abstract]:Objective : To study the relationship between miR - 455 - 5p - 5p - 5p - 5p - 5p and miR - 455 - 5p in the lung of fetal mice . The average optical density of miR - 455 - 5p was 0.280 卤 0.184 and 1.992 卤 0.169 , 2.937 卤 0.079 and 2.105 卤 0.148 , 2.937 卤 0.021 and 3.315 卤 0.043 respectively .
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R725.6
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