STAT6和ORMDL3在哮喘小鼠肺内的表达及布地奈德的干预作用

发布时间：2018-02-06 02:09

本文关键词： 哮喘 STAT6 ORMDL3 气道重塑小鼠　出处：《郑州大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：支气管哮喘（bronchial asthma）是儿童时期最常见的慢性呼吸道疾病之一。以气道高反应、可逆性气流受限和肺功能降低为主要表现。哮喘的发病机制非常复杂，是一种免疫、环境、遗传等多因素共同介导的疾病。目前其具体的发病机制尚未明确，其中Th1/Th2亚群比例失衡和功能失衡仍为目前公认的免疫学发病机制。酪氨酸激酶/信号转导和转录激活子（JAK/STAT）信号转导通路是胞内一条重要信号转导通路，IL-4、IL-13等多种细胞因子及炎症介质可通过该路通介导发挥生物学作用。信号转导和转录激活子（signal transduction andactivator of transcription, STAT）蛋白家族是一组胞质蛋白，经过磷酸化后转位至细胞核内，与特定的反应元件结合，活化靶基因，调节相关基因的转录。STAT6是STAT家族中的一员，是Th2细胞特异性的转录因子，被IL-4、IL-13等细胞因子激活后促使Th2细胞的增殖、分化，导致Th2细胞功能亢进，而Th2细胞功能亢进在哮喘的发病机制中起到重要作用。血清类黏蛋白1样蛋白3（orosomucoid1-like3, ORMDL3）基因是2007年发现的与儿童哮喘的发生有密切关系的哮喘易感基因[1]。其编码位于内质网（endoplasmic reticulum,ER）上由153个氨基酸组成的跨膜蛋白，ORMDL3基因虽为哮喘易感基因，但是其与气道重塑的关系仍不明了。本研究建立哮喘气道重塑模型，应用布地奈德混悬液（budesonide,BUD）进行干预治疗，观察气道重塑改善情况，STAT6及ORMDL3的表达情况，探讨二者参与哮喘的可能机制。目的建立哮喘小鼠气道重塑模型，观察气道壁厚度、炎症细胞浸润、上皮下纤维化情况，检测肺组织中STAT6mRNA及其蛋白和ORMDL3mRNA的表达情况，以及布地奈德的干预对其表达的影响。材料和方法 1实验小鼠分组和哮喘模型制作 SPF级雌性BALB/c小鼠30只，体重20～25g，饲养1周使其适应环境后，按随机数字法分为对照组、哮喘组和干预组，每组10只。应用鸡卵清蛋白（OVA）致敏及激发建立哮喘小鼠模型，干预组在每次激发前30min应用BUD进行雾化吸入，对照组应用生理盐水替代OVA溶液。 2肺组织标本的制备各组小鼠分别在末次激发结束后24h内，处死，打开胸腔，充分暴露双肺，将左肺保存于-80℃冰箱中，用于ELISA及RT-PCR检测；右肺中叶经4%甲醛外固定，石蜡包埋，3μm切片，用于苏木精-伊红（HE）染色、马松三染色（Masson）及免疫组化。 3HE染色及Masson染色切片经脱蜡后，分别行HE染色和Masson染色。高倍显微镜下观察气道结构改变及炎症细胞浸润情况，并测定同级别支气管的管壁厚度。 4免疫组化染色采用SP法行免疫组织化学染色：脱蜡、脱水、抗原修复、封闭内源性过氧化物酶、加一抗、4℃过夜、滴加二抗、显色、复染、分化、封片等严格遵从免疫组织化学染色步骤操作。在显微镜高倍镜（10×40）下观察、摄片。每个标本随机择取5个高倍镜视野范围，应用医学病理图像分析系统进行STAT6蛋白测定，结果用积分光密度(IOD)值表示。 5ELISA法检测肺组织IL-13水平将保存于-80℃冰箱的肺组织研磨成匀浆，按照IL-13试剂盒说明检测各组肺组织匀浆中IL-13水平。 6RT-PCR检测STAT6mRNA、ORMDL3mRNA表达取出保存于-80℃冰箱的肺组织（约100mg），提取总RNA，用反转录试剂盒反转录为cDNA，设计引物并扩增目的基因片段。扩增产物进行凝胶电泳，用D-140图像记录分析系统进行分析，目的基因STAT6mRNA、ORMDL3mRNA的表达量以其DNA条带灰度值和内参GAPDH的DNA条带灰度值的比值计算。 7统计学分析采用SPSS17.0统计软件对数据处理。计量资料数据用均数±标准差(X S)表示，组间样本均数差异性比较采用单因素方差分析，采用LSD-t法进行两两比较，两个因素之间相关性采用pearson相关分析，以=0.05为检验水准。结果 1各组小鼠病理形态学改变在普通光学显微镜高倍镜（10×40）下观察：对照组气道壁完整，厚度正常，上皮细胞排列正常，少量炎性细胞。哮喘组气道结构紊乱，表现为支气管壁增厚、杯状细胞化生、粘液分泌增多、胶原纤维沉积，，大量炎性细胞浸润。干预组气道结构紊乱情况较哮喘组减轻，炎性细胞较哮喘组减少。根据单因素方差分析结果：F=109.43，P0.05，三组小鼠气道管壁厚度差异有统计学意义，进一步进行两两比较，哮喘组气道壁厚度(160.50±21.38μm)较干预组(84.50±15.45μm)及对照组(48.70±9.84μm)增高，干预组气道壁厚度较对照组增高，差异有统计学意义。 2各组小鼠免疫组化结果三组小鼠肺组织中均有STAT6蛋白表达，其主要分布于上皮细胞及炎症细胞胞浆中，表现为棕黄色颗粒。根据单因素方差分析结果：F=66.118，P0.05，三组间小鼠肺组织STAT6蛋白表达差异有统计学意义，进一步进行两两比较，哮喘组STAT6蛋白的表达水平(123.40±19.60)较干预组(80.00±10.43)及对照组(49.30±11.59)增高，干预组较对照组增高，差异有统计学意义。 3各组小鼠肺组织IL-13水平三组小鼠肺组织中均有IL-13表达。根据单因素方差分析结果：F=416.988，P0.05，三组间小鼠肺组织IL-13水平差异有统计学意义，进一步进行两两比较，哮喘组IL-13水平(56.00±2.6ng/mgpro)较干预组(37.20±2.7ng/mgpro)及对照组(26.40±1.5ng/mgpro)增高，干预组较对照组增高，差异有统计学意义。 4各组小鼠肺组织内STAT6及ORMDL3mRNA检测结果半定量测定结果显示：STAT6mRNA及ORMDL3mRNA在三组中均有表达。二者均为哮喘组条带亮度最强，干预组次之，对照组条带亮度最弱。根据单因素方差分析结果：F=92.472，P0.05，三组间小鼠肺组织STAT6mRNA的相对表达量差异有统计学意义，进一步进行两两比较，哮喘组STAT6mRNA的相对表达量(0.78±0.08)较干预组(0.52±0.05)及对照组(0.38±0.07)增高，干预组较对照组增高，差异有统计学意义。根据单因素方差分析结果：F=290.457，P0.05，三组间小鼠肺组织ORMDL3mRNA的相对表达量差异有统计学意义，进一步进行两两比较，哮喘组ORMDL3mRNA的相对表达量(0.340±0.032)较干预组(0.194±0.026)及对照组(0.075±0.013)增高，干预组较对照组增高，差异有统计学意义。 5相关分析 Pearson相关分析示哮喘组STAT6mRNA及ORMDL3mRNA的表达水平呈正相关（r=0.676，P=0.032）；STAT6mRNA及ORMDL3mRNA的表达均与气道壁厚度呈正相关，相关系数分别为（r=0.738，P=0.015r=0.668，P=0.035）。结论 1. STAT6和ORMDL3可能参与了小鼠气道重塑过程。 2.布地奈德可能通过下调STAT6mRNA及其蛋白和ORMDL3mRNA的表达，改善气道炎症及重塑。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R725.6

【参考文献】