心脏舒张功能障碍中cTnI低表达的表观遗传机理及干预研究

发布时间：2018-04-19 05:16

  本文选题：cTnI + 心脏舒张功能障碍　； 参考：《重庆医科大学》2016年博士论文

【摘要】：第一部分小鼠心脏cTnI基因时序表达规律及衰老小鼠心脏形态及功能目的:心肌肌钙蛋白I(cTnI)是调控心脏舒缩功能的重要心肌纤维蛋白,其正常表达对心脏功能特别是舒张功能的维持至关重要。流行病学研究发现心脏舒张功能障碍在老年人群中较为常见,可能与老年人心脏中cTnI含量下降有关。因此本部分研究将阐明小鼠出生至衰老期cTnI基因转录表达的时序性规律,并对衰老期小鼠心脏形态及功能进行评测,为研究心脏舒张功能障碍奠定模型基础。方法:1、以近交系健康清洁级c57小鼠为研究对象,时间点分别选取NB,2w,3m,10m及18m。获取各组小鼠心脏组织进行如下检测:western blot检测cTnI与c Tn T蛋白表达水平;Q-PCR检测cTnI m RNA表达水平;2、以3m和18m小鼠为研究对象,利用高频超声检测其心脏功能:左室短轴切面测量小鼠心脏收缩功能,分别检测IVS、LVID及LVPW,计算左室EF及FS值;四腔心切面测量二尖瓣血流速度,评价E/A比值,IVRT及IVCT值;3、取3m及18m小鼠心肌组织,利用透射电镜及HE染色分别对心肌超微结构及大体心脏形态进行观察。结果:1、3m小鼠心脏中cTnI蛋白及m RNA水平显著高于新NB、2w及18m;与10m间对比无显著差异(NB,2w,18m vs.3m p0.05;10m vs.3m p0.05)。c Tn T蛋白在各组间表达水平无显著差异(p0.05);2、IVS、LVID、LVPW、EF及FS值在3m及18m之间小鼠之间无显著性差异(p0.05)。而18m组小鼠IVRT较3m组小鼠显著延长,E/A比值显著降低,p0.05;IVCT则在两组间无显著差异,p0.05;3、3m小鼠心脏超微结构无明显异常,18m小鼠心肌细胞Z线增粗、肌丝发生溶解及水样变性、肌浆网扩大。两组小鼠心脏大体形态未见显著异常。结论:1、小鼠心脏中cTnI蛋白及m RNA从新生表达开始升高,3m达高峰,18m表达回落;2、衰老期小鼠存在心脏舒张功能障碍,而收缩功能无明显改变;3、衰老期小鼠心肌超微结构出现明显破坏。第二部分衰老期小鼠心脏舒张功能障碍中cTnI基因低表达的表观遗传机理目的:第一部分研究发现衰老期小鼠心脏cTnI蛋白及m RNA水平均显著降低,提示cTnI下降可能发生在其自身转录水平。DNA甲基化通过对基因Cp G岛及启动子CG位点的修饰调控基因表达,而组蛋白乙酰化通过对基因染色质的动态调控而影响基因转录。因此本部分研究从DNA甲基化及组蛋白乙酰化为切入点,探讨衰老期小鼠心脏cTnI降低的表观遗传学机理。方法:研究对象同前。获取小鼠心脏组织进行如下检测:1、利用MSP及BSP检测cTnI启动子-1500bp左右Cp G岛及cTnI启动子关键顺式作用元件GATA及Mef2元件散在CG位点DNA甲基化水平;2、利用Ch IP-PCR技术检测cTnI启动子关键顺式作用元件区域组蛋白H3、H3K9、H3K27乙酰化水平;3、采用Ch IP-PCR方法检测与cTnI关键顺式作用元件对应转录因子GATA4和Mef2c的结合水平。1、各组小鼠cTnI启动子上游Cp G岛和GATAMef2元件散在CG位点均存在DNA甲基化;但各组间cTnI基因Cp G岛及启动子关键元件散在CG位点DNA甲基化水平无显著差异,p0.05;2、3m组小鼠cTnI启动子关键元件区域组蛋白H3及H3K9水平显著高于NB、2w及18m组;与10m组间对比无显著差异(NB,2w,18m vs.3m p0.05;10m vs.3m p0.05);3m组小鼠cTnI启动子关键元件区域组蛋白H3K27乙酰化水平显著高于NB及2w,与10m及18m间对比无显著统计学差异(NB,2w vs.3m p0.05;10m,18m vs.3m p0.05);3、3m组小鼠心脏中GATA4和Mef2c与cTnI启动子GATAMef2元件结合水平显著高于NB、2w及18m组;与10m组间对比无显著差异(NB,2w,18m vs.3m p0.05;10m vs.3m p0.05)。结论:1、DNA甲基化可能并未参与cTnI基因时序性表达;2、衰老期小鼠心脏cTnI启动子关键元件区域组蛋白H3K9乙酰化水平显著降低,转录因子GATA4及Mef2c与之结合水平亦降低,提示cTnI启动子关键元件区域组蛋白H3乙酰化可能参与调控cTnI时序性表达。结果:第三部分EGCG上调cTnI基因表达改善衰老期小鼠心脏舒张功能目的:第二部分研究发现cTnI启动子区域组蛋白低乙酰化可能是引起衰老期小鼠cTnI低表达的机理之一,近期研究发现EGCG(儿茶素)能上调组蛋白H3K9乙酰化水平,因此本部分实验选择EGCG作为干预剂,明确体内水平EGCG干预对老年小鼠心脏cTnI表达及心脏舒张功能的影响,并探讨其内在机理。方法:以16m老年期小鼠为研究对象,将其随机分为空白对照组(16m)、16m+DMSO组、16m+EGCG组,给予16m小鼠EGCG处理,50mg/kg/d,腹腔注射,连续处理8周,待小鼠18m时停止干预,以3m小鼠为对照进行如下检测:1、采用高频超声评价18m+EGCG小鼠心脏功能,与3m及18m组小鼠进行比对;2、利用Western blot及Q-PCR检测各组小鼠心脏中cTnI蛋白及m RNA表达水平;检测各组心肌组织中HDAC1、HDAC2及HDAC3m RNA表达水平;3、利用Ch IP技术检测cTnI启动子GATAMef2元件区域组蛋白H3K9乙酰化水平,HDAC1、HDAC2、HDAC3与关键元件结合水平,转录因子GATA4、Mef2c与cTnI启动子关键元件结合水平。结果:1、18m+EGCG组小鼠心脏IVTR较18m组显著降低,E/A比值则显著升高(p0.05),但与3m组无显著性差异(p0.05);2、18m+EGCG组小鼠心脏cTnI m RNA和蛋白表达量较18m及18m+DMSO组显著增加(p0.05),与3m组间无显著差异(p0.05);3、18m及18m+DMSO组HDAC1及HDAC3 m RNA水平显著低于18m+EGCG及3m组(p0.05),而HDCA2 m RNA水平在各组间无显著差异(p0.05);4、18m+EGCG组小鼠cTnI启动子关键元件区域组蛋白H3K9乙酰化水平高于18m及18m+DMSO组(p0.05),与3m组间无统计学差异(p0.05);5、18m+EGCG组及3m组HDAC1与cTnI启动子结合关键元件结合水平显著低于18m及18m+DMSO组(p0.05),而HDAC2及HDAC3与cTnI启动子结合水平在各组间无显著差异(p0.05);6、GATA4和Mef2c与cTnI启动子关键元件结合水平在18m+EGCG组及3m组高于18m及18m+DMSO组,差异具有统计学意义(p0.05)。结论:1、EGCG干预可以显著改善衰老小鼠心脏舒张功能;2、EGCG干预可能通过抑制心脏中HDAC1表达,进而降低其与cTnI启动子结合水平,引起衰老期小鼠心脏cTnI启动子关键元件区域组蛋白H3K9乙酰化水平升高,促进对应转录因子与之结合,提升cTnI表达。
[Abstract]:The first part of the mouse heart cTnI gene sequential expression of cardiac morphology and function of aging mice and objective: cardiac troponin I (cTnI) is an important regulatory protein of myocardial fibers of cardiac diastolic and systolic function, the normal expression of cardiac function is critical to maintain diastolic function. Epidemiological studies have found that diastolic dysfunction is common in the elderly, may the content of cTnI in the elderly and heart decreased. This part of the study will elucidate the mice to regular sequential expression during senescence of cTnI gene transcription, and to evaluate the morphology and function of aging mice during the dirty heart, lay the foundation for the study of the model of cardiac diastolic dysfunction. Methods: 1 inbred healthy C57 mice as the research object, time points were selected NB, 2W, 3M, 10m and 18m. to obtain the heart tissue of mice were as follows: Western blot detection cT detection nI涓巆 Tn T铔嬬櫧琛ㄨ揪姘村钩;Q-PCR妫，

本文编号：1771735