γ-分泌酶抑制剂DAPT急性期干预Notch信号通路对新生大鼠缺血性脑损伤的作用和机制研究

发布时间：2018-12-09 13:21

【摘要】：新生儿缺血性脑损伤是由各种原因造成的新生儿局灶或广泛性脑血流中断,脑组织发生缺血缺氧性改变而出现相应的神经功能障碍。包括多种可以引起脑动／静脉血栓形成或栓塞的原发病因如窒息、先天性心脏病、全身性感染、休克、血液高凝状态、严重失血／贫血等。近年来的临床资料表明新生儿期缺血性脑损伤的发病率被低估并有上升趋势,造成远期严重的神经功能缺陷。治疗的核心内容是最大程度地保留和恢复受损区域神经细胞的数量及功能,涉及细胞凋亡／死亡、内源性神经干细胞增殖／分化、定植整合和血供等多个环节,受众多细胞信号通路介导并协调控制。目前已知的主要信号通路包括：死亡受体通路、蛋白激酶途径、Toll样受体和清道夫受体CD36信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶通路(PI3K-Akt/ERK)和核因子κB通路等。Notch信号通路在生物学进化上相当保守,通过细胞膜上配体-受体结合释放胞内活性片段,结合转录因子的方式激活下游靶基因,实现相邻细胞之间的信号传递。对于神经系统的重要意义在于调控胚胎期的神经发育。但Notch受体及配体同样广泛表达于出生后至成年期的脑组织中,参与调节不同成熟阶段神经细胞的迁移和分化、形态可塑性、突触可塑性和细胞命运。因此有理由推测Notch信号通路和脑缺血损伤后的细胞应答修复机制密切相关。成年期缺血性脑卒中的研究已经证实缺血可诱导Notch信号通路发生变化、并同时产生加重损伤和促进神经再生的多种异质性作用。这充分说明激活的Notch信号通路在缺血后发挥的影响有着细胞种类特异性、成熟度依赖性和受具体损伤条件限制的特点。新生儿期的脑缺血损伤具有独特的发病因素和预后,处于不同发育阶段、分布于不同脑区的各类神经构成细胞对于缺血打击的耐受和反应不完全一致,与发育成熟的大脑存在显著差异；且目前对于Notch信号通路在新生儿缺血性脑损伤中作用尚无确切的资料,亟待进一步的研究,或许有助于发现新的干预治疗靶点。本研究旨在建立新生大鼠缺血性脑损伤模型,考察不同脑缺血情况下Notch信号通路变化特点；并采用γ-分泌酶抑制剂DAPT (N-[N-(3, 5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-Butyl Ester)在缺血急性期干预Notch信号通路的经典活化途径,验证药理学方法抑制缺血后该信号通路有效性；在此基础上,研究DAPT对缺血损伤后脑组修复的影响以及相关的细胞现象和分子机制。从细胞凋亡、神经发生、新生细胞分化、血管发生以及基因表达调控神经发生等多角度说明Notch信号通路在未成熟期脑缺血性损伤中的作用,为今后有效防治新生儿缺血性脑卒中提供一定的实验依据。目的：建立新生大鼠脑缺血损伤模型,明确缺血损伤区域(缺血半影区) Notch信号通路表达变化特点,以及急性期应用Y-分泌酶抑制剂DAPT是否能有效抑制脑组织内该通路活化水平；评价采用该药理学手段干预脑内Notch信号通路对缺血脑组织的保护作用及预后的影响；从神经细胞凋亡、神经发生、迁移分化、血管发生等方面进一步分析Notch信号通路在缺血损伤后发挥作用的可能途径,以及涉及的相关神经发生基因表达情况。方法：1.动物模型和药物干预：出生后10天的Sprague-Dawley大鼠(P10)分别采用永久性结扎双侧颈总动脉建立持续性全脑低灌注缺血模型(Hypoperfusion)和线栓法短暂阻断单侧大脑中动脉建立暂时性局灶性脑缺血模型(Transient focal ischemia)。两种模型均进一步分为缺血组和DAPT干预组,DAPT干预组在缺血1小时后腹腔注射DAPT(100mg/kg)一次,缺血组则在缺血1小时后腹腔注射等量生理盐水。对照组动物接受假手术而不作动脉结扎或阻断处理。缺血术后分各时间点(术后1天、2天、5天、7天、14天、21天、28天)测定各组大鼠体重、评估一般情况；术后第4周时,采用转棒试验评估大鼠脑缺血后远期的运动协调功能。并于术后第5天取各组部分实验对象脑组织进行Western blot检测,比较Notch信号通路关键分子NICD、Hes1、Hes5的表达水平变化。2. DAPT干预对脑缺血损伤后短期存活率、梗死范围和远期运动功能的影响：以缺血术后第5天为时间点,统计不同组别的存活率,比较DAPT干预对短期生存的影响；取缺血后24小时的暂时性局灶性脑缺血模型脑标本,三苯基氯化四氮唑(TTC)染色显示梗死灶,作梗死灶大小的定量分析和比较；在缺血后第4周采用转棒实验评估DAPT干预对缺血后远期运动功能的影响。3. DAPT干预机制的分析：在不同测定时间点采集各组大鼠的脑组织标本,液氮速冻后80℃低温冷冻保存或4%多聚甲醛固定做冰冻切片。缺血后24小时为观察时间点,采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL法)检测缺血半影区的细胞凋亡。采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)连续腹腔注射(缺血术后1小时、24小时和48小时各一次,每次50mg/kg)后,于缺血后第5天取脑切片,免疫组化方法研究不同脑区细胞增殖水平；并采用免疫荧光双重标记的方法考察增殖细胞的分化特点和类型。取缺血后第14天的脑标本切片作缺血半影区血管基底膜标志物免疫荧光染色,半定量分析血管发生的水平。采用表达谱基因芯片技术检测缺血后第5天时暂时性局灶性脑缺血模型半影区组织中与神经发生及干细胞分化有关的基因mRNA表达水平,并用荧光定量逆转录聚合酶链反应技术(qRT-PC R)进行验证。结果：1.P10 SD大鼠采用双侧劲动脉永久结扎和线栓法短暂阻断大脑中动脉两种方法分别模仿持续性全脑低灌注缺血和暂时性局灶性脑缺血可以建立新生儿期缺血性脑损伤的动物模型。缺血手术后的大鼠表现为活力减退、体重下降,以术后1周内最为明显。缺血后第4周时缺血组大鼠的运动功能受到损伤。2.缺血引起脑组织内Notch信号通路激活。缺血后第5天时两种不同缺血模型NICD、Hes1和Hes5的蛋白表达水平均较对照组显著提高(分别为P0.05,P0.001,P0.001)；采用急性期DAPT干预可以有效抑制该通路在缺血后的活化(P0.001,和缺血组相比较),NICD的水平甚至低于对照组的基础水平(Hypoperfusion模型24.31±5.73%, Focal ischemia模型37.44±2.93%,P0.001)。3. DAPT急性期干预提高了缺血后模型动物的短期存活比率。缺血后第5天时,DAPT干预组的存活率明显高于缺血组(Hypoperfusion模型：77.8%：33.3%；Focal ischemia模型：72.7%：33.3%,P0.05)。4.在暂时性局灶性脑缺血模型上,急性期DAPT干预使得缺血后24小时的梗死灶范围较缺血组下降了22.26%(P0.001)。5.急性期DAPT干预明显改善两种不同缺血模型缺血后第4周时大鼠的运动功能(和缺血组相比较,P0.05)。6.急性期DAPT干预在两种不同缺血模型上均能减少缺血后24小时的缺血半影区细胞凋亡的发生(P0.001)。7.缺血发生后第5天,两种不同缺血模型的梗死灶周边移行区增殖细胞数量明显高于对照组(P0.05),DAPT干预进一步提高这种新生细胞的聚集现象(P0.05,和缺血组相比)。与之相反的,侧脑室下区的增殖细胞密度受到缺血的抑制(P0.05,和对照组相比),DAPT则能逆转这一趋势(P0.05,和缺血组相比)。8.在暂时性局灶性脑缺血模型的缺血半影区内,DAPT提高了缺血后第5天时N estin+/BrdU+共定位细胞比例,同时降低了Ibal+/BrdU+共定位细胞比例(P0.05,和缺血组比较)。9. DAPT干预提高了缺血后14天时暂时性局灶性脑缺血模型半影区的血管密度(P0.05,和缺血组比较)。10.在暂时性局灶性脑缺血模型上,基因芯片检测结果显示缺血和DAPT两种因素都会引起和神经发生、干细胞分化相关的基因表达水平变化。DAPT干预诱导了7种新的基因表达(对照组和缺血组均阴性),显著上调了其他2种基因的表达(对照组阳性,和缺血组相比变化倍数1.5)；同时重新沉默了4种基因的表达(对照组阴性而缺血组阳性),并显著下调了其他11种基因的表达(对照组阳性,和缺血组相比变化倍数1.5)。表达水平上调和被诱导的基因产物主要和细胞增殖、突触功能、细胞黏附、转录因子以及G-蛋白耦联受体信号通路有关,而表达下调的基因则与G-蛋白耦联受体信号通路、细胞周期阻滞、细胞迁移／黏附、转录／生长因子等细胞动能有关。qRT-PCR检测对7种组间变化倍数1.5倍的基因mRNA进行扩增和定量分析,所得到的变化趋势和在基因芯片上观察到的相一致。结论：1.新生未成熟脑发生缺血性损伤可以激活Notc h信号通路。采用Y-分泌酶抑制剂DAPT急性期干预可以有效抑制该通路的活化水平。2. DAPT急性期抑制Notch信号通路提高新生儿期未成熟脑缺血性损伤后的短期存活率,缩小局灶性缺血模型的梗死范围,并改善远期的运动功能。3.新生儿期未成熟脑缺血后DAPT抑制Notch信号通路所产生的神经保护作用与抑制细胞凋亡、诱导细胞增殖、调控分化、促进增殖细胞在受损区域聚集及血管发生有关。4.缺血后DAPT急性期抑制Notch信号通路可以调控部分和神经发生、干细胞分化相关的基因表达水平。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R722.1

【参考文献】