先天性巨结肠的肠道菌群及代谢组学分析研究

发布时间：2020-03-21 03:56

【摘要】：背景:先天性巨结肠又称希尔施普龙病(Hirschsprung’s disease,HSCR),是丹麦医生Hirschsprung于1886年首次描述。发病率约1/5000活产新生儿,HSCR的病因是的远端肠壁内无神经节细胞,其病理生理机制是由于肠神经系统(ENS)缺失,而没有神经介导的推进运动模式,导致远端肠段处于痉挛狭窄状态,近端结肠蓄便、积气继发扩张和肥厚渐渐造成了巨结肠病变。HSCR的主要症状包括便秘,呕吐,腹胀和生长障碍。未经治疗的患儿,通常会因为在肠道炎症(小肠结肠炎)或肠穿孔的情况下,血流细菌感染发生儿童时期死亡。目前HSCR的发病机制尚未完全明了,但已发现的与先天性巨结肠发病密切相关的易感基因有十多种,如RET、GDNF、ECE1、EDN3、NRTN、SOX10、PHOX2B、NRG1等。除基因组学外,考虑肠道微环境变化对ENS的发育有影响。肠道菌群是目前研究的新热点,其不仅是体内最复杂、最重要的微生物动态系统,还与机体以及外部环境之间保持动态平衡关系起到至关重要的作用。稳定的菌群环境有利于婴幼儿的生长发育和免疫系统建立。肠道中有着约1000种细菌,总数为1 X10~(14)个,厚壁细菌和拟杆菌是肠道菌群中的主要细菌,约占肠道菌群总数的90%。这些定居在肠道的微生物与人体相互依存共生,它们与宿主之间和平共处,彼此间相互依赖且相互制约。目前有文献证明先天性巨结肠患者的双歧杆菌和乳酸菌低于正常人,拟杆菌及厚壁变形菌多于正常人。先天性巨结肠的发生是由于多个基因突变和肠道微环境紊乱等因素共同作用的复杂过程。是否存在肠道菌群改变或者代谢产物异常,而可能在先天性巨结肠发病的作用,只有解决以上问题,为深入认识该病提供理论依据。代谢组学技术是一门新兴的、对生物体液和粪便等排泄物进行检测及分析的方法,其通过遗传修饰或生理刺激的代谢产物的变化来研究生物体系的代谢途径。该技术通过在先天性巨结肠中找到关键代谢物及相关代谢通路,进一步探讨先天性巨结肠的病因机制。目的:本研究通过肠道菌群及代谢组学分析,探讨先天性巨结肠患者的肠道菌群及代谢通路差异,以期找到与发病存在相关的信号通路,为HSCR的综合诊断治疗开展了新方向。方法:(1)选取2018年4月至2018年12月在天津市儿童医院新生儿外科治疗的先天性巨结肠患儿13例及其母亲9例粪便与对照正常儿及其母亲组4例(无消化系统疾病以及1个月内未使用抗生素的患儿及其母亲)。患者入选的标准:先天性巨结肠患儿经过病理学检查确诊,粪便收集前30日内未使用糖皮质激素和任何抗生素;其母亲无饮酒不良嗜好;年龄介于0-15岁之间,男女性别比保持均衡。排除标准:近一月有急性腹泻病史的患儿或者有慢性腹泻史。将入选患者及其母亲分别记为组1(group1,n=13),组2(group2,n=9)。对照组选择无消化系统疾病以及1个月内未使用抗生素的患儿及其母亲。对照组的儿童及母亲分别记为组3(group3,n=4),组4(group4,n=4)。收集研究对象的临床资料、血浆标本和粪便标本。提取粪便DNA,并对16S rDNA的V4-V5高变区进行PCR扩增。采用高通量测序法,并对测序回来的数据进行分析,并通过构建物种进化树、Alpha多样性、Beta多样性和LEfSE分析先天性患儿肠道的菌群分布结构,多样性及丰度分析,采用PICRUSt软件进行16S功能预测分析,找到差异通路,差异蛋白和RNA。(2)用液相色谱仪-质谱仪(LC-MS)对收集的研究对象进行检测全谱代谢组检测,找到差异代谢物,分析与之相关的代谢通路,进一步揭示可能存在的调控作用及机制。结果:1.从整体菌群分布看,发现两组样本菌群在总水平上的丰富度及种类差异有统计学意义(P0.01)。2.KEGG功能预测结果显示在lever2水平,HSCR患儿的内分泌系统、神经系统、免疫系统、次生代谢物产物系统和细胞转化迁移的表达低,系统调控能力差,易发生紊乱失调。在lever3水平,PPAR信号通路、脂肪细胞因子通路、糖磷脂生物合成、鞘脂(神经脂质)代谢、亚油酸代谢、次级胆汁酸生物合成、初级胆汁酸生物合成、类NOD受体信号通路、孕酮-介导的卵母细胞成熟和类黄酮生物合成的含量低,提示HSCR患儿的脂代谢合成障碍,这可能与HSCR发病机制呈负相关。HSCR母亲组与正常母亲组相比,并无明显差异,则遗传关联性小。3.COG功能预测结果显示COG1183、COG1640和COG0464等蛋白质的低表达,证明了HSCR患儿的脂代谢、碳水化合物代谢和细胞信号转导障碍参与HSCR发病。4.对比分析HSCR患儿与正常对照组的全代谢谱特征,结果发现HSCR患儿亚油酸代谢、胆汁分泌、鞘脂类代谢、肿瘤中的胆碱代谢、磷脂酶D信号通路、脂肪消化吸收和PPAR信号通路有明显差异,神经鞘氨醇、乳糖苷、鞘磷脂、鞘氨醇磷酸胆碱、胆固醇酯、胆固醇、胆汁化合物、卵磷脂、前列腺素α2、磷脂酰胆碱、脂肪酸、磷脂(C00865)、9,10-二羟基十八碳-12-烯酸和9,10,13-三羟基辛基-11-烯酸下调;L-谷氨酸、磷脂(C00416)、溶血磷脂酰胆碱、四乙基、9S-羟基十八碳二烯酸及13S-羟基十八碳二烯酸上调。HSCR的致病机制与脂质代谢存在关联可能性。结论:基于高通量测序及代谢组学分析,HSCR患儿的脂代谢、碳水化合物代谢和细胞信号传导的障碍,可能阻碍肠神经系统发育。另一方面两部分研究都分析显示患儿的PPAR信号通路差异。
【图文】：

病理切片,患儿

样本中的细菌 16S rRNA 的 V4-V5 区进行生物学信息分析，探讨先天性巨结肠患儿的肠道微生物的特征及优势菌群变化情况，从而为 HSCR 病因及分子机制研究、临床诊治及预防提供更加有力的理论依据。1.1 实验对象和方法1.1.1 实验对象（1）随机选取 2018 年 4 月至 2018 年 12 月在天津市儿童医院新生儿外科治疗的先天性巨结肠患儿 13 例及其母亲 9 例粪便与对照正常儿及其母亲组 4 例（无消化系统疾病以及 1 个月内未使用抗生素的患儿及其母亲）。HSCR 患儿组男 10 例女 3 例。年龄 39 时~36 月，平均 5.6±9.6 月。（2）患者入选的标准：先天性巨结肠患儿经过钡餐灌肠检查诊断巨结肠病变，直肠组织活检（直肠黏膜或全层）：直肠结肠处未见典型神经节细胞确诊。如图 1-1 所示。年龄介于 0-15 岁之间，粪便收集前 30 日内未使用糖皮质激素和任何抗生素；其母亲无饮酒不良嗜好；排除标准：近一月有急性腹泻病史的患儿或者有慢性腹泻史。

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10图 1-2 生物信息学分析流程图样本所包含的 OTU 的总数，，观察随样U 是指核心 OTU，是所有样本共有的TU 数目的减少情况。具有不同测序数量的样本物种的多样逐渐平坦，说明更多的取样也只会产所有物种几乎全覆盖；反之说明样品本量的需要。0 OTU 的序列绘制进化树。系统发育排序物种亲缘度，判断差异物种归属样本内物种多样性，常用的指标有 C
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R722.1

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