人偏肺病毒感染后Toll样受体的表达及功能

发布时间：2020-03-28 09:04

【摘要】： 第一部分人偏肺病毒感染人肺上皮细胞后Toll样受体的表达目的观察人偏肺病毒感染人肺上皮细胞后Toll样受体表达变化及其信号通路的功能,探讨hMPV诱导气道炎症的部分机制。方法hMPV感染体外培养的人肺上皮细胞株A549,检测病毒在A549细胞中的生长曲线,并通过RT-PCR,real-time RT-PCR方法检测细胞TLRs mRNA的表达,ELISA检测细胞培养上清干扰素-α及肿瘤坏死因子-α的表达。结果(1)hMPV可在A549细胞中复制,感染后3天达高峰105.2TCID50/mL。(2)RT-PCR结果提示:hMPV感染A549细胞6小时后大部分TLRs的表达均上调。(3)定量PCR结果提示:hMPV感染A549细胞后TLR3-4,TLR7-9的表达增高,且有时间依赖性,而紫外灭活的hMPV刺激细胞后TLRs表达无明显变化。(4)ELISA结果提示hMPV 1感染后24小时,IFN-α及TNF-α的表达均明显升高。结论人偏肺病毒感染A549细胞后可上调Toll样受体表达,其诱导的炎性反应与部分Toll样受体介导的信号转导途径有关。第二部分人偏肺病毒感染小鼠肺内Toll样受体表达及PolyI:C对病毒感染的影响目的探讨人偏肺病毒感染BALB/c小鼠后肺组织Toll样受体表达变化及PolyI:C对病毒复制的影响。方法实验分为hMPV感染组、PolyI:C+hMPV组、polyI:C+DMEM组、DMEM对照组,均于滴鼻后1、3、5、7、9、16天处死小鼠,取肺组织用于病毒滴度测定,病理检查,通过RT-PCR,real-time RT-PCR方法检测小鼠肺组织TLRs mRNA的表达。结果(1)PolyI:C+hMPV组与hMPV感染组相比,病毒在小鼠肺内复制水平明显减低,仅在感染后第5天及第7天检测到病毒;病理结果亦提示肺部炎症明显减轻。(2)RT-PCR结果提示:hMPV感染组小鼠与DMEM对照组相比,肺组织内大部分TLRs mRNA表达均升高。(3)real-time PCR结果提示:hMPV感染后小鼠肺组织TLR7-8 mRNA增高最为显著,且有时间依赖性;滴鼻后24小时PolyI:C+hMPV组TLR3的表达明显升高。结论人偏肺病毒感染BALB/c小鼠后,可上调小鼠肺组织Toll样受体表达,其中TLR7/8通路可能在启动天然免疫应答中起着重要作用; PolyI:C可通过早期活化TLR3,抑制hMPV在小鼠肺内的复制,并减轻肺部炎症。
【图文】：

细胞病变效应,感染后

感染后5-6天逐渐发展为细胞脱落、漂浮；感染后5-6天CPE可达75%左右。hMPV感染A549细胞后，细胞也于感染后3天出现典型的细胞病变，表现为融合，拉网状改变（图1-1）。图 1-1 细胞病变效应（×200）Fig 1-1. The cytopathogenic effectA Normal Vero-E6 cell B CPE of Vero-E6 cell post infected with hMPVC Normal A549 cell D CPE of A549 cell post infected with hMPV

生长曲线,间接免疫荧光法,感染后,荧光显微镜

IFA检测中未感染细胞在荧光显微镜下呈红色，，而感染细胞则可见特异性的绿色荧光。将感染后3天的A549细胞进行间接免疫荧光检测，荧光显微镜下观察到特异性绿色荧光，而未感染病毒的A549细胞则未观察到绿色荧光（图1-2）。图 1-2 间接免疫荧光法检测 A549 细胞中的 hMPVFig1- 2. The IFA assay in A549 cells infected hMPV.A Negative control A549 cells with IFA-negative stainingB hMPV infected A549 cells with obvious IFA-positive staining2.3 hMPV 在 A549 细胞中的生长曲线A549细胞感染hMPV后病毒滴度逐渐升高，感染后1-7天病毒滴度分别为：103.5TCID50/mL、104.6TCID50/mL、105.2TCID50/mL、105.0TCID50/mL、104.4TCID50/mL、103.9TCID50/mL、103.7TCID50/mL。可以看出于感染后第3天时达到高峰为105.2TCID50/mL，之后逐渐降低，但仍在一定时间内维持较高水平，第7天仍可达103.7TCID50/mL(图1-3)。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R725.6

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