胆道闭锁致病基因的检测及功能研究

发布时间：2020-04-02 17:35

【摘要】： 胆道闭锁(biliary atresia, BA)是儿童最常见的严重肝脏疾病,病因至今未明,既往的研究多局限于某些炎症细胞或因子在发病中的作用,但是不同的细胞与细胞间,分子与分子间存在复杂的网络联系,这些细胞和因子哪些处于始动环节,哪些处于核心通路或是相应的下游环节,始终未能阐明。为进一步阐明该病的发病机制,本研究借助基因芯片及生物信息学技术在全基因组水平对基因表达谱及基因间的相互关系进行研究。对于所得到的关键基因对其在胆道闭锁肝脏中的表达及突变情况进行了验证。同时在体外细胞培养中对可能存在的关键调控基因的功能进行深入研究。目的利用基因芯片技术及生物信息学方法对胆道闭锁的基因表达谱进行研究,以进一步阐明该病的发病机制。方法Trizol一步法提取胆道闭锁组及胆总管囊肿组肝脏组织的总RNA,利用人全基因组基因表达芯片研究胆道闭锁及胆总管囊肿肝脏组织基因表达谱间的差异,并对所得差异基因进行表达趋势显著性及功能分析、信号传导通路显著性分析,并构建基因间相互作用网络,寻找在胆道闭锁发病过程中的显著性的基因表达趋势、信号通路及关键调控基因。结果胆道闭锁与胆总管囊肿相比存在1000余条差异基因；通过对表达谱芯片所得差异基因的分析,得到： (1)趋势21及23两个最具显著性的表达趋势。趋势21的基因功能主要涉及组织相容性抗原复合物Ⅱ介导的外源性抗原呈递作用以及由此导致的免疫反应。趋势23的基因功能主要涉及器官组织发育、细胞外基质形成,阴离子转运与磷酸基团转运。(2)趋势21涉及的显著性通路主要为细胞凋亡调控(与炎症及组织重构有关),细胞基质代谢以及细胞粘附、花生四烯酸类物质的合成(与炎症反应相关)；趋势23主要涉及细胞基质代谢(参与组织重构)、炎症反应、花生四烯酸类物质的合成、增殖与迁移能力。 (3)其中趋势21的关键基因包括ITGAM、ITGB2、TNFSFR21、RGS19,趋势23的关键基因包括LAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11。 (4)通过基因调控网络构建发现LDOC1基因可能在胆道闭锁发病中起关键调控作用。结论 (1)胆道闭锁的发病与MHCⅡ类分子介导免疫炎症及组织重构密切相关。 (2)其中ITGAM、ITGB2、TNFSFR21、RGS19和LAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11分别在趋势21和趋势23中具有重要作用。 (3)LDOC1基因可能在胆道闭锁发病过程中起着核心调控作用。目的：研究第一部分实验中发现的胆道闭锁中关键基因的表达及突变情况,以验证基因芯片结果并进一步揭示该病的发病机制。材料与方法： (1)22例胆道闭锁患儿和14例胆总管囊肿患儿手术活检肝脏标本,利用RT-PCR方法对趋势21和趋势23所发现的关键基因ITGAM、ITGB2、TNFRSF21、RSG19和LAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11进行了半定量检测。同时以Real-time PCR的方法对LDOC1基因进行了定量检测。 (2)抽取10例胆道闭锁患儿外周静脉血2ML,抽提基因组DNA,对目的基因ITGB2和LDOC1基因外显子进行扩增纯化并测序,了解其突变及SNP改变情况。结果： (1)胆道闭锁肝脏组织中ITGAM、ITGB2、TNFRSF21、RSG19、LAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11及LDOC1均较胆总管囊肿明显升高(P0.05)。 (2)对ITGB2基因16个外显子进行PCR扩增、纯化、测序,测序结果与NCBI参考序列进行比对,发现：9例患儿(9/10)存在ITGB2基因单核苷酸多态性改变。这些改变包括3个突变和11个SNP改变。其中突变分别是N212Y(2/10),Y544H(1/10),P752S(4/10)；SNP改变包括：-156T/C(5/10),117G/A(1/10),919G/A(5/10),1101C/A(4/10),1533C/T(1/10),3’-UTR+123C/T(4/10),3’-UTR+140G/A(4/10),3’-UTR+148C/A(6/10),3’-UTR+170C/T(8/10),3’-UTR+219T/C(1/10),3’-UTR+286C/T(3/10)。LDOC1基因仅有1个外显子,与参考序列相比,在3例患儿(3/10)存在单核苷酸多态性改变。共有1处SNP改变,为3’UTR+822C/T。结论 (1)胆道闭锁中,ITGAM、ITGB2、TNFRSF21、RGS19、LAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11、LDOC1等关键基因表达升高,这些基因的功能主要涉及免疫炎症及细胞外基质重建,说明它们可能参与胆道闭锁炎症及纤维化的进程。 (2)胆道闭锁中ITGB2基因外显子区存在多处突变及单核苷酸改变。LDOC1基因外显子区存在1处SNP改变。这些突变可能导致相关蛋白结构及功能改变,从而参与胆道闭锁的发病。而SNP改变的存在,可能与胆道闭锁的疾病易感性相关。目的：体外研究LDOC1基因高表达对T淋巴细胞Thl类炎症因子表达的影响。方法：体外构建pIRES2-EGFP-LDOC1质粒,将pIRES2-EGFP-LDOC1和空白质粒pIRES2-EGFP重组并包装腺病毒,感染Jurkat细胞,利用westernblot的方法研究LDOC1蛋白的表达,利用Elisa的方法研究无转染组、pAD-LDOC1-IRES2-EGFP组和PAd-IRES2-EGFP组细胞在静息状态和PMA激活状态下Thl类炎症因子TNF-α、IL-2、IFN-γ的表达情况。结果：成功构建pIRES2-EGFP-LDOC1质粒,并利用腺病毒包装后转染Jurkat细胞。转染LDOC1组(pAD-LDOC1-IRES2-EGFP组)较阴性转染组(PAd-IRES2-EGFP组),LDOC1蛋白表达明显升高。转染LDOC1组(pAD-LDOC1-IRES2-EGFP组)较阴性转染组(PAd-IRES2-EGFP组),在静息状态下在炎症因子产生上并无明显差异,但在经PMA刺激后,LDOC1组(pAD-LDOC1-IRES2-EGFP组)较阴性转染组(PAd-IRES2-EGFP组)TNF-α、IL-2、IFN-γ的表达均明显升高,经统计学检验具有显著性差异(p值分别为0.0099、0.0043和0.0026)。结论：在Jurkat细胞中高表达LDOC1可以促进炎症因子TNF-α、IL-2、IFN-γ表达升高。而胆道闭锁中存在LDOC1基因表达升高,提示其可能对Thl类细胞因子表达具有促进作用,从而加剧胆道闭锁中持续而炎症的免疫损伤。
【图文】：

电泳图,电泳图,甲醛,凝胶

总RNA电泳图

趋势,基因表达,显著性水平,数字

利用GBMS生物信息分析平台对获得的1000余条差异基因数据进行分析，得到如下结果:1.显著性基因表达趋势及功能分析(图4)Pro栩es“ deredbasedonthe卜vakleslgn欣aneeof侧月油erotg即esass冲陇dversusexPected圈.1圈.恻园团口目涵目目日口曰因圈园口翘曰图日圈曰图4基因表达趋势(注:每种趋势的左上角的数字为趋势编号;左下角值为P值，，如profilezl的显著性水平P值为1、10一，‘，其中着色部分为显著性表达趋势，而绿色部分为最具显著性表达趋势，后续实验选择最具显著性的表达趋势21和23进行深入分析)经过趋势分析，我们发现胆道闭锁和胆总管囊肿间存在显著差异，而胆道闭锁的三张芯片内部并无明显差异。其中绿色部分的趋势21和趋势23的基因表达趋势具有最显著性差异，根据基因功能分布发现，趋势21主要涉及组织相容性抗原复合物n介导的外源性抗原呈递作用以及由此导致的免疫反应，该作用主要涉及的细胞内定位为溶酶体。趋势23主要涉及器官组织发育、细胞外基质形成，阴离子转运与磷酸基团转运。这些功能导致了胆道闭锁与胆总管囊肿的主要差异。2.显著性信号转导通路分析
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R726.5

【参考文献】