不同维生素A水平儿童肠道菌群对无菌小鼠肠粘膜屏障功能的影响

发布时间：2020-04-06 04:23

【摘要】：目的:分别将VAN、VAD儿童粪便移植入无菌小鼠体内,探索不同VA营养水平肠道菌群对无菌鼠肠道粘膜屏障功能的影响。方法:收集重庆渝中区幼儿园血清视黄醇水平≥1.05mmol/L(VA充足)或0.70mmol/L(VA缺乏)的健康儿童粪便,分别移植给四周龄Balb/c无菌小鼠后,构建VAN优势菌群作用小鼠组(VAN-FMT)及VAD优势菌群作用小鼠组(VAD-FMT)。28天后,HE染色观察小鼠小肠及结肠组织病理形态变化;Western blotting检测小鼠小肠组织紧密连接相关蛋白Occludin和Claudin-1的表达变化;ELISA检测小鼠血清DAO、IgA及盲肠粪便SIgA的含量;流式细胞仪检测Peyper Patch结中树突状细胞、肠系膜淋巴结中B细胞、上皮间淋巴细胞(IELs)、固有层T淋巴细胞、脾脏中Treg细胞及T细胞亚群的比例。16s rRNA测序技术对小鼠结肠粘膜菌群进行检测。结果:实验期间各组小鼠一切正常,粪菌移植4周后各组间小鼠体重无统计学差异。HE染色发现VAN-FMT组小鼠的小肠及结肠粘膜发育均较VAD-FMT及无菌小鼠成熟,且VAD-FMT组小鼠结肠黏膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润。VAN-FMT小鼠小肠Occludin和Claudin-1的表达水平较VAD-FMT及无菌小鼠均明显升高(P(27)0.01,P(27)0.001),而VAD-FMT组仅Occludin蛋白表达水平较无菌小鼠明显增加(P(27)0.01)。VAN-FMT小鼠血清DAO水平显著低于VAD-FMT及无菌小鼠组。VAN-FMT小鼠粪便SIgA含量显著高于无菌对照小鼠(P(27)0.05),SIgA含量在VAD-FMT及无菌小鼠组间无统计学差异;血清IgA浓度在三组间无显著差异。VAN-FMT小鼠MLN中B淋巴细胞的比例显著低于VAD-FMT组(P(27)0.05)及无菌小鼠(P(27)0.001),同时VAD-FMT组MLN中B淋巴细胞比例也明显低于无菌小鼠组(P(27)0.05)。VAN-FMT组小鼠PP结中DCs的比例显著高于VAD-FMT组(P(27)0.001)和无菌小鼠组(P(27)0.05),而VAD-FMT小鼠的DCs比例却显著低于无菌小鼠(P(27)0.05)。三组小鼠肠上皮间淋巴细胞中CD8~+TCRgd~+T淋巴细胞的百分比变化无统计学差异。小肠固有层中的CD4~+T淋巴细胞的比例在VAN-FMT组(P(27)0.001)及VAD-FMT组(P(27)0.001)均显著高于无菌小鼠,但VAN-FMT与VAD-FMT两组间无统计学意义。LPLs中的CD8~+T淋巴细胞的比例在三组间无显著性差异。同时发现VAN-FMT小鼠固有层中CD4~+CD8~+双阳性T淋巴细胞比例较VAD-FMT(P(27)0.05)及无菌小鼠(P(27)0.01)均显著增加,但后两组间无统计学差异。16s rRNA测序分析结果显示,VAN-FMT及VAD-FMT小鼠结肠黏膜菌群组成具有很高的相似性,且两组的ACE、Chao、Shannon、Simpson多样性指数无统计学差异(P0.05)。在门水平两组均以厚壁菌门及拟杆菌门为主,其中Proteobacteria在VAN-FMT小鼠显著增加(P0.05);在属水平,VAN-FMT组丰度最高的菌属为Bacteroides,其中Helicobacter(P=0.03)及Lachnospiraceae(P=0.005)显著性增加;而VAD-FMT组丰度最高的菌属为Staphylococcus。LEfSe分析显示VAN-FMT组有29个对分组有显著差异的物种,而VAD-FMT组有10个对分组有显著差异的物种。结论:VAN儿童肠道菌群的粪菌移植可显著促进无菌小鼠的肠道发育成熟,上调肠上皮细胞间的紧密连接相关蛋白Occludin和Claudin-1的表达水平,增强小肠上皮屏障功能。同时VAN-FMT降低MLN中B淋巴细胞比例,诱导PP结中的树突状细胞成熟分化,促进B细胞从MLN向肠道归巢并分泌IgA,增加固有层中CD4~+、CD4~+CD8~+T细胞比例,表明VAN儿童肠道菌群可能是通过其优势菌属Bacteroides诱导无菌鼠肠道天然粘膜免疫活性;而VAD儿童肠道菌群则以机会致病菌葡萄球菌属为主,且Prevotella增加,从而导致VAD-FMT小鼠肠道出现炎症,对无菌鼠肠道粘膜免疫调节作用减弱。
【图文】：

version 5.0 软件进行统计。两组间丰度的比较美吉生物医药科技有限公司提供的 I-Sanger 显著性的差异。及体重的实验周期内，粪菌液移植前各组小鼠体质量饮食饮水及大小便正常。实验期间，各组小结束时无菌小鼠组、VAN 菌群移植组及 VAD统计学差异（P>0.05）（见图 1）。

组小鼠结肠黏膜完整、光滑，黏膜上皮完整、连续，腺体排列规则整齐，，结构清晰，无炎性细胞浸润。而 VAD-FMT 组的结肠黏膜完整，但腺体排列存在部分破坏，黏膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润（图 2）。表 1 FMT 小鼠小肠形态学比较（ ±s,μm）Table 1 Morphological comparison of small intestine in the mice following FMT.组别 小肠绒毛高度 小肠隐窝深度 黏膜层厚度 全层厚度Control 295.1±8.11 50.12±4.828 390.5±9.869 413.3±11.31VAN-FMT 352.6±7.749a*100.5±7.303a***471.0±31.65a*514.1±37.31a**VAD-FMT 308.5±43.39 54.32±4.906b***387.6±41.67b*407.8±34.29b**Note:aCompared with Control,bCompared with VAN-FMT*P＜0.05;**P<0.01;***P<0.001
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R725.7

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本文编号：2616002