miR-145-3p对SD大鼠肠神经干细胞增殖与分化作用探究

发布时间：2020-05-05 21:11

【摘要】：研究背景先天性巨结肠(Hirschsprung disease,HSCR)又称肠无神经节细胞症,是一类与肠神经嵴细胞发育异常相关性疾病,其病理特点为病变肠段粘膜下及肌间神经丛神经节细胞缺如。神经节细胞缺如是由于肠神经嵴细胞(Enteric neural crest cells,ENCCs)增殖、迁移、分化和定植出现障碍,从而导致肠神经系统(Enteric nervous system,ENS)发育异常,引起胃肠道调控功能失衡并带来一系列的临床问题。要研究肠神经系统的生长发育过程,就必须运用合适的肠神经发育来源的细胞模型,但目前缺乏更合适的工具细胞来研究肠神经系统的形成过程。MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核生物体内的小RNA分子,长度约为21-25个核苷酸。miRNA主要通过与目的基因mRNA3'非编码区以不完全碱基配对结合方式降低mRNA稳定性或抑制目的基因的翻译。而miRNA的异常表达靶向调控目的基因从而影响先天性巨结肠及肠神经系统的形成。前期通过miRNA基因芯片检测先天性巨结肠表达谱发现,多种miRNA明显上调,而miR-145-3p先天性巨结肠狭窄段中的表达量明显高于扩张段3倍以上。目前,也有不少研究关于miRNA与先天性巨结肠的研究,但大部分研究所用工具细胞为神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y及293T细胞系。因为肠神经嵴细胞提取鉴定困难,难以完成后续的功能实验。所有,选择适合的工具细胞研究先天性巨结肠及肠神经系统发育是非常有必要的。本研究通过提取来源于SD大鼠的肠神经干细胞(Enteric neural stem cells,ENSCs)分析其生物学特性,通过构建LV-miR-145-3p基因过表达慢病毒载体,感染体外培养的肠神经干细胞,进而探究miR-145-3p对肠神经干细胞增殖分化的影响,寻找到最佳的转染方式,为先天性巨结肠等肠神经系统发育异常性疾病提供了合适的工具细胞。研究目的1.探究SD大鼠肠神经干细胞原代培养及鉴定;2.探究不同转染方式对转染肠神经干细胞的作用效果;3.探究过表达miR-145-3p对肠神经干细胞增殖分化的作用。研究方法1.通过原代培养提取不同孕龄SD大鼠肠神经干细胞,比较其神经球生长情况,并行Nestin及GFAP鉴定其为神经干细胞。2.细胞分为过表达组、阴性对照组及空白对照组,分别运用脂质体及慢病毒载体对肠神经干细胞进行miR-145-3p过表达转染,荧光显微镜下观察转染效果,并运用RT-qPCR进行miR-145-3p过表达验证。3.运用Edu细胞增殖实验,荧光鉴定各组细胞增殖情况,记录各组Edu/DAPI阳性的比例。用神经干细胞分化培养基使各组神经球分化,记录分化后细胞GFAP/DAPI 比例。研究结果1.成功提取孕18天SD大鼠胎鼠肠管细胞,免疫荧光结果显示原代培养细胞细胞Nestin和GFAP阳性,证明所提取的细胞为肠神经干细胞。2.miR-145-3p过表达慢病毒成功感染神经球后,细胞生长良好,95%以上细胞能均匀表达GFP绿色荧光,且实时荧光PCR结果显示,miR-145-3p过表达组的相对表达量是对照组的275.85倍,差异具有统计学意义(P0.05),证明慢病毒成功转染肠神经干细胞。3.Edu细胞渗入实验结果显示,与过表达对照组相比较,miR-145-3p过表达组EdU阳性率为15.23±1.17%,NC对照组EdU阳性率为22.38±1.52%,过表达组较NC对照组显著下降,差异具有统计学意义(P0.05)。在分化培养基中处理之后miR-145-3p过表达组GFAP阳性细胞比例为21.47±1.98%,NC对照组为33.86±2.52%,过表达组分化细胞数目较对照组明显减少,差异具有统计学意义(P0.05),过表达miR-145-3p可抑制肠神经干细胞的增殖分化。
【图文】：

图１－１神经干细胞形态学结果（倒置显微镜ｘｌＯＯ）逡逑Ｆｉｇｌ－１邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＥＮＳＣｓ邋（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ邋ｘ邋１００）逡逑１．３．２肠神经干细胞鉴定逡逑在培养生长良好的神经球，，运用免疫荧光对悬浮神经球作Ｎｅｓｔｉｎ鉴定及分逡逑化后ＧＦＡＰ鉴定。结果显示有９５％以上的细胞显示Ｎｅｓｔｉｎ阳性表达及分化后逡逑９逡逑

第二章ｍｉＲ－１４５－３ｐ对肠神经干细胞增殖与分化的影响逡逑ＴＴＴＴＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＴＡＡＧＡＴＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴＴＧＴＡＡＧＴＣＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＡＡ逡逑ＧＧＴＡＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＴＣＣＧＡＣＴＣＧＴＣＴＧＡＧＧＧ逡逑ＣＧＡＡＧＧＣＧＧＡＧＡＣＧＣＧＧＡＡＧＡＧＧＣＣＧＣＡＧＡＧＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＣＧＧ逡逑ＧＡＡＧＧＡＡＧＧＴＣＣＧＣＴＧＧＡＴＴＧＡＧＧＧＣＣＧＡＡＧＧＧＡＣＧＴＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＧ逡逑ＴＣＣＣＧＣＧＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＡＣＡＣＡＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＡＡＡＧＧＡ逡逑ＣＧＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＣＡＡＣＡＣＣＡＣＧＧＡＡＴＴＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＡＡＣＡＧＣＣＧＡＧ逡逑ＣＣＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＡＧＣＧＧＧＣＡＡＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＡＴＧＡＧＴＴＣＣＧＣＣＧＴＧＣＡＡ逡逑ＴＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＧＡＡＡＧＴＣＣＣＧＧＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣ逡逑ＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＧ．逡逑■逦３：Ｃ逦Ｊ；０逦３３：逦３？０逡逑：逦：邋ｉ邋Ａ邋Ｓ邋＇逦５邋Ｇ邋：逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R725.7

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本文编号：2650759