Hoxd-13在肛门直肠畸形大鼠胚胎肛门直肠发育中表达的研究

发布时间：2020-05-22 21:24

【摘要】： 目的先天性肛门直肠畸形(Anorectal Malformations,ARMs)是最常见的消化道畸形。病理改变非常复杂,且疾病谱广,表型多种多样,遗传方式不清楚,病因及胚胎形成机制至今未完全阐明。因此,从胚胎学和分子生物学探索先天性肛门直肠畸形的发病机制和致病基因具有十分重要的意义。近年来,动物实验研究证实Hoxd-13基因与先天性肛门直肠畸形的发生有关。本研究应用免疫组织化学染色技术和RT-PCR方法,观察Hoxd-13在正常和乙烯硫脲(ethylenethiourea,ETU)致畸的肛门直肠畸形大鼠胚胎肛门直肠发育过程中的表达情况,旨在探讨Hoxd-13基因在先天性肛门直肠畸形发生机制中的作用。材料与方法一、肛门直肠畸形动物模型的建立应用乙烯硫脲致畸制作Wistar大鼠肛门直肠畸形动物模型(n=20)。成熟健康Wistar孕鼠妊娠第10天(E10),经胃管按125mg/kg体重投以1%ETU,对照组投以等量的生理盐水。分别在大鼠妊娠第13天、14天、15天、16天、18天、21天剖宫取胎。一部分标本备石蜡切片免疫组化染色之用,另一部分标本备RT-PCR之用。二、Hoxd-13石蜡切片免疫组化染色大鼠胚胎标本经4%多聚甲醛固定、脱水后制成蜡块,行矢状面连续切片,连续动态观察胎龄13～21天(E13～21)正常及肛门直肠畸形大鼠胚胎肛门直肠的形态学变化过程。选正中矢状面石蜡切片进行Hoxd-13免疫组织化学染色,连续动态对比观察Hoxd-13在正常和肛门直肠畸形大鼠胚胎肛门直肠发育过程中的表达情况。三、Hoxd-13 mRNA RT—PCR 在解剖显微镜下应用手工显微切割方法准确切取泄殖腔/后肠标本,提取总RNA,通过RT—PCR方法研究Hoxd-13 mRNA在正常和肛门直肠畸形大鼠胚胎肛门直肠发育过程中的表达情况。结果一、连续石蜡切片观察形态学变化过程在正常大鼠胚胎发育过程中,观察到尿直肠隔进行性下降,与泄殖腔膜之间的距离越来越小,直至E15,尿直肠隔与泄殖腔膜融合,使腹侧的尿生殖窦与背侧的后肠完全分离。E16,肛膜破裂,直肠与外界相通。而在肛门直肠畸形大鼠胚胎发育过程中,与同龄正常大鼠胚胎相比,尿直肠隔发育较差,与泄殖腔膜之间的距离较大,E15未观察到二者融合,E16-21观察到直肠尿道瘘(泄殖腔畸形)的存在。二、Hoxd-13免疫组织化学染色结果 (一)Hoxd-13表达的部位正常大鼠胚胎中,Hoxd-13阳性区域主要分布于尿直肠隔的间质以及后肠、泄殖腔膜或肛管/瘘管和尿生殖窦的上皮层。肛门直肠畸形组的大鼠胚胎,阳性区域主要集中于尿生殖窦上皮层。 (二)Hoxd-13表达的水平在两组大鼠胚胎中,Hoxd-13平均光密度值随着胎龄的增长呈总体增加的趋势,＞E16表现明显。与对照组比较,肛门直肠畸形组大鼠胚胎尿直肠隔间质、后肠上皮层、泄殖腔膜或肛管(瘘管)上皮层平均光密度值明显减小,有统计学意义(P＜0.05)。E18和E21,比较无明显差异。Hoxd-13在肛门直肠畸形组各胎龄大鼠胚胎尿生殖窦上皮层平均光密度值较对照组无明显差异。三、Hoxd-13 mRNA RT—PCR半定量检测结果在正常和肛门直肠畸形大鼠胚胎肛门直肠中均能检测出Hoxd-13基因的表达,Hoxd-13mRNA扩增条带在ARMs组呈弱带或无带,在对照组均呈亮带。其相对表达量随着胎龄的增长呈总体增加的趋势,＞E16明显增强。E13-16,肛门直肠畸形组Hoxd-13基因的表达水平明显低于对照组,有统计学差异(P＜0.05)。E18和E21,两组比较无明显差异。RT-PCR结果与免疫组化结果一致。结论 Hoxd-13在E13-16肛门直肠畸形与正常大鼠胚胎肛门直肠表达部位的区别在于:尿直肠隔间质以及后肠(直肠)上皮层、泄殖腔膜或肛管(瘘管)上皮层表达减弱,这种改变可能影响了尿直肠隔与泄殖腔膜的融合,从而导致肛门直肠畸形的发生。Hoxd-13在大鼠胚胎肛门直肠的差异表达,提示Hoxd-13基因可能与肛门直肠畸形的发生有关。
【图文】：

泄殖腔,后肠,红色

Hoxd一13在E13大鼠胚胎泄殖腔区的表达情况。对照组:A，B;组:a，b。红色虚线框所示分别为图B和图b的区域。H:hindgut，后肠;ARMSURS:uroreetalseptum，尿直肠隔;UGS:urogenitalsinus，尿生殖窦;泄殖腔管;CM:cloaealmembrane，泄殖腔膜。(A，a:4OX;CLB，:eloaealeanal，b:400X)
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R726.5

【参考文献】