去泛素化酶USP4通过RLR信号通路调控肠道病毒71型感染的机制和功能研究
发布时间：2020-06-23 14:34
【摘要】：目的:研究去泛素化酶USP4通过RLR信号通路调控肠道病毒71型感染的机制和功能,深入了解EV71感染及其逃逸免疫防御关系,为临床治疗EV71感染提供新的理论依据。方法:利用PCR芯片技术筛选去泛素化酶在EV71感染横纹肌肉瘤细胞(RD)后的表达差异;EV71感染AG129小鼠收集左后腿肌肉组织,RT-PCR检测病毒载量和USP4 m RNA的表达情况;去泛素化酶USP4表达质粒转染RD细胞,RT-PCR和Western blot检测EV71病毒的复制情况,同时流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测EV71感染RD细胞后IRF3和NF-κB p65蛋白及其磷酸化水平;poly(I:C)激活RLR信号通路,si RNA干扰或质粒转染去泛素化酶USP4时检测NF-κB荧光素酶报告基因活性;免疫共沉淀检测去泛素化酶USP4与TRAF6之间的结合作用,共转染USP4、TRAF6和Ub检测去泛素化酶USP4对TRAF6的功能研究;构建EV71非结构蛋白2A和3C质粒,探讨USP4降解机制;加入MG132、Q-VD和STS,进一步研究2A蛋白酶切割USP4的机制。结果:去泛素化酶USP4在EV71感染过程中表达下调,而EV71感染小鼠后USP4m RNA的表达也受到抑制。去泛素化酶USP4的高表达可抑制EV71增殖并且减少细胞凋亡。EV71的感染抑细胞中IRF3和NF-κB p65的磷酸化。USP4正性调控RLR诱导的NF-κB信号通路,对IFN信号通路没有明显变化;TRAF6是RLR抗病毒信号通路中激活NF-κB的关键蛋白,而去泛素化酶USP4通过对TRAF6分子K48去泛素化抑制其降解,从而激活下游炎症因子的表达,发挥抗病毒作用。另外,EV71中的非结构蛋白2A可通过剪切USP4蛋白而降低该蛋白功能;STS诱导细胞的凋亡不会出现USP4的切割;MG132和Q-VD抑制后,2A蛋白酶依然切割USP4。结论:去泛素化酶USP4在RLR抗病毒信号通路中起到正性调控的作用;EV71感染宿主细胞后利用非结构蛋白2A剪切USP4蛋白,促进TRAF6蛋白通过蛋白酶体的降解,以达到抑制宿主细胞的免疫应答,维持病毒自身增殖,从而达到逃逸宿主免疫防御作用。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R725.1
【图文】：
23图 1 去泛素化酶 USP4 在 EV71 感染过程中表达下调（A）EV71 感染 RD 细胞后 8 h，收集细胞并提取 RNA，反转后，做 PCR 基因芯片，图中所列为几个去泛素化酶变化明显的结果。误差线（平均数±标准差） （B） RT-PCR 分析 EV71 感染AG129 小鼠后，小鼠左下肢肌肉组织中 VP1 基因的表达情况。（C） RT-PCR 分析 EV71 感染AG129 小鼠后，小鼠左下肢肌肉组织中 USP4 基因的表达情况。（D）EV71 感染 RD 细胞后收集个小时点 RNA, RT-PCR 检测 USP4 基因的表达情况 （E） EV71 感染 RD 细胞后收集个小时点蛋白，Western blot 检测 USP4 蛋白的表达情况 （F） Western blot 分析 EV71 感染 AG129 小鼠后，小鼠左下肢肌肉组织中 USP4 及 VP1 蛋白的表达情况。（“*”表示 P<0.05, “**”, 表示 P<0.01,“*** ” 表示 P<0.001）
25图 2 去泛素化酶 USP4 参与细胞中抗 EV71 感染天然免疫反应（A）空载质粒为对照组，HA-USP4 质粒转染至 RD 细胞 48 h 后， 加入 EV71 病毒（MOI=0.5），12 h 光镜下观察拍照。 （B） 空载质粒为对照组 HA-USP4 质粒转染至 RD 细胞 48 h 后，加入EV71 病毒（MOI=0.5），12 h 收集细胞上机流式检测凋亡。（C） 和（D）空载质粒为对照组，HA-USP4 质粒转染至 RD 细胞 48 h 后，加入 EV71 病毒（MOI=0.5），收集 0 h、8 h、12 h 和 24h 细胞提 RNA，RT-PCR 检测 USP4 和 EV71/VP1 的表达。 （E） 空载质粒为对照组，HA-USP4质粒转染至 RD 细胞 48 h 后，加入 EV71 病毒（MOI=0.5） ，收集 0 h、8 h、12 h 和 24 h 细胞提蛋白，Western blot 检测 USP4（HA）、VP1 和 GAPDH。（F）RD 细胞分别转染 HA-USP4 和对照组空载 48 h 后，EV71 病毒（MOI=0.5）感染细胞，然后收集细胞和上清，运用空斑实验检测病毒滴度。（“*”表示 P<0.05, “**”, 表示 P<0.01, “*** ” 表示 P<0.001）
本文编号：2727471
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R725.1
【图文】：
23图 1 去泛素化酶 USP4 在 EV71 感染过程中表达下调（A）EV71 感染 RD 细胞后 8 h，收集细胞并提取 RNA，反转后，做 PCR 基因芯片，图中所列为几个去泛素化酶变化明显的结果。误差线（平均数±标准差） （B） RT-PCR 分析 EV71 感染AG129 小鼠后，小鼠左下肢肌肉组织中 VP1 基因的表达情况。（C） RT-PCR 分析 EV71 感染AG129 小鼠后，小鼠左下肢肌肉组织中 USP4 基因的表达情况。（D）EV71 感染 RD 细胞后收集个小时点 RNA, RT-PCR 检测 USP4 基因的表达情况 （E） EV71 感染 RD 细胞后收集个小时点蛋白，Western blot 检测 USP4 蛋白的表达情况 （F） Western blot 分析 EV71 感染 AG129 小鼠后，小鼠左下肢肌肉组织中 USP4 及 VP1 蛋白的表达情况。（“*”表示 P<0.05, “**”, 表示 P<0.01,“*** ” 表示 P<0.001）
25图 2 去泛素化酶 USP4 参与细胞中抗 EV71 感染天然免疫反应（A）空载质粒为对照组，HA-USP4 质粒转染至 RD 细胞 48 h 后， 加入 EV71 病毒（MOI=0.5），12 h 光镜下观察拍照。 （B） 空载质粒为对照组 HA-USP4 质粒转染至 RD 细胞 48 h 后，加入EV71 病毒（MOI=0.5），12 h 收集细胞上机流式检测凋亡。（C） 和（D）空载质粒为对照组，HA-USP4 质粒转染至 RD 细胞 48 h 后，加入 EV71 病毒（MOI=0.5），收集 0 h、8 h、12 h 和 24h 细胞提 RNA，RT-PCR 检测 USP4 和 EV71/VP1 的表达。 （E） 空载质粒为对照组，HA-USP4质粒转染至 RD 细胞 48 h 后，加入 EV71 病毒（MOI=0.5） ，收集 0 h、8 h、12 h 和 24 h 细胞提蛋白，Western blot 检测 USP4（HA）、VP1 和 GAPDH。（F）RD 细胞分别转染 HA-USP4 和对照组空载 48 h 后，EV71 病毒（MOI=0.5）感染细胞，然后收集细胞和上清，运用空斑实验检测病毒滴度。（“*”表示 P<0.05, “**”, 表示 P<0.01, “*** ” 表示 P<0.001）
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 陈姝樾;刘龙丁;;肠道病毒71型结构蛋白和非结构蛋白的分子生物学特性[J];国际生物制品学杂志;2014年04期
本文编号：2727471
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/eklw/2727471.html
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