sEHi对人冠状动脉内皮细胞及川崎病小鼠心脏血管病变的影响

发布时间：2020-07-29 21:39

【摘要】：研究背景:川崎病(Kawasaki disease,KD)是一种全身性自限性血管炎,主要发生于5岁以下的儿童。该疾病的主要且严重的并发症是冠状动脉病变(coronary artery leision,CAL),CAL被认为是目前儿童获得性心脏病的主要原因。在全球范围内,中国儿童川崎病发病率仅次于韩国和日本,居第三位。川崎病首例报告至今已有50年,尽管该病的病因不是太明确,但有研究表明川崎病多发生于有遗传易感性的儿童,并在某些特定的感染原作用下发病。异常免疫反应也被认为是该疾病临床前期和急性期的关键。急性期大剂量静脉注射免疫球蛋白(IVIG)以及中至高剂量阿司匹林是目前治疗的黄金标准。尽管IVIG作用的具体机制仍不清楚,但其广泛的抗炎作用被认为是治疗川崎病的一个重要因素。然而,大约20%的川崎病患儿对大剂量IVIG没有明显反应,表现为发热不退和炎性指标不下降。另外,对初始IVIG治疗反应失败后的替代疗法目前国内外没有确定的统一方案,导致CAL的发病率居高不下。因此,寻找更有效治疗方案是非常有必要的。环氧二十碳三稀酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)是一种环氧脂肪酸,EETs能以自分泌和旁分泌的形式在病理生理条件下发挥很多的生物学作用,包括抗炎、抗凋亡、抗纤维化、抗氧化剂等,另外有证据表明EETs在多种心血管疾病中有保护作用,包括减轻心脏损伤、抗高血压、促进血管修复等作用。然而EETs在体内能被可溶性环氧化物水解本科(soluble epoxide hydrolase,sEH)快速水解为无活性的碳十三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids,DHETs)。而可溶性环氧化物水解酶抑制剂(sEH inhibitors,sEHi)可以通过抑制这个途径能够有效增加血浆和组织中EETs的含量,从而增强EETs的各种生理学作用。12-(3-adamantan-1-yl-ureido)-dodecanoic acid(AUDA)是一种可溶性环氧化物水解酶抑制剂,可以通过抑制sEH的水解作用从而增加EETs的含量,增强EETs的抗炎及血管修复作用。新近研究表明,AUDA除了有抑制sEH的作用外,它自身还有抗炎和降压的作用。而AUDA是否对川崎病血管炎反应和冠脉损伤有保护作用尚未见报道。目的:1.研究AUDA对人冠状动脉内皮细胞(human coronary arterial endothelial cells,HCAECs)迁移、粘附、增殖和新生血管形成功能的影响及机制,探讨AUDA是否具有促进血管修复的作用。2.研究AUDA对川崎病小鼠心脏组织及血管病理及炎症因子的影响,探讨AUDA是否具有抗血管炎的作用。3.研究EETs在川崎病患儿外周血中的表达变化及临床意义。方法:1.AUDA对HCAECs细胞迁移、细胞粘附、细胞增殖及血管生成功能的影响及可能机制研究1.1 将不同浓度的(0、1、10、50、100、100μmol/L+5 μmol/LGW9662)AUDA处理的HCAECs添加至transwell板上层,检测sEHi对HCAECs细胞迁移功能的影响;1.2 将不同浓度AUDA(0、1、10、50、100、100 μmol/L+5pmol/L GW9662)干预的HCAECs加入人纤维连接蛋白包被的96孔培养板,检测sEHi对HCAECs细胞粘附功能的影响;1.3 采用CCK-8法检测不同浓度AUDA(0、1、10、50、100、100 pmol/L+5 pmol/L GW9662)对HCAECs细胞增殖功能的影响;1.4 将不同浓度AUDA(0、1、10、50、100、100 μmol/L+5 μmol/LGW9662)处理的HCAECs加入Matrigel包被的96孔培养板,检测sEHi对HCAECs细胞血管生成功能的影响。1.5采用实时荧光定量RT-PCR法和ELISA法检测100 μmol/L AUDA干预后PPARγ的表达变化;将PPARγ特异性siRNA/PPARγ过表达质粒转染入HCAECs细胞,采用CCK-8法检测细胞增殖变化,以探讨AUDA在HCAECs细胞中的作用靶点和信号转导通路。2.采用干酪乳杆菌细胞壁成分(LCWE)诱导C57BL/6小鼠川崎病模型,分析AUDA对小鼠冠状动脉炎症反应的影响,并进一步从蛋白和基因水平检测心脏组织中TNF-α、IL-1β、MMP-9炎症因子的表达变化。2.1实验小鼠随机分为四组,每组5例,分别为:PBS组,LCWE组,LCWE+AUDA组,LCWE+AUDA+GW9662组;2.2分别在第3、14、28天处死小鼠,取小鼠心脏组织,一部分心脏组织立即置于-80℃冰箱保存备检,一部分心脏组织石蜡包埋固定、切片,进行HE染色,观察小鼠心脏组织炎症变化。2.3采用实时荧光定量RT-PCR法和ELISA法分别检测各组小鼠心脏组织中14,15-EET的mRNA和蛋白表达水平;2.4选择腹腔注射各组药物后第14天的小鼠为研究对象,取小鼠心脏组织切片进行HE染色,检测各组小鼠心脏组织炎症反应变化情况;2.5选取腹腔注射各组药物后第14天的小鼠为研究对象,采用ELISA法检测小鼠心脏组织中TNF-α、IL-1β、MMP-9蛋白的表达变化;2.6以注射各组药物后第14天的小鼠为研究对象,实时荧光定量RT-PCR法检测小鼠心脏组织中TNF-α、IL-1β、MMP-9基因的表达。3.检测EETs在川崎病患儿外周血中的表达变化及其与冠脉损伤的关系3.1收集川崎病患儿及健康对照组的外周血样本(均签署知情同意书),并用统计学方法分析各组的临床资料;3.2分别采用实时荧光定量RT-PCR法和ELISA法检测14,15-EET在各组样本中的mRNA和蛋白含量,分析其与冠脉损伤的关系。3.3分别利用实时荧光定量RT-PCR法和ELISA法检测TNF-α、IL-1β和MMP-9在各组样本中的mRNA和蛋白含量,分析其与冠脉损伤的关系。结果:1.AUDA对HCAECs细胞迁移,细胞粘附,细胞增殖及血管生成功能的影响:1.1随着加入AUDA浓度的增加,迁移细胞的数量逐渐增多,提示AUDA以浓度梯度的方式促进HCAECs的迁移,与0μmol/LsEHi组相比,差异具有统计学差异(P0.05),给予PPARγ抑制剂GW9662干预后,细胞的迁移能力降低(P0.05)。1.2随着加入AUDA浓度的增加,细胞粘附的数量逐渐增多,提示AUDA以浓度梯度的方式促进HCAECs的粘附,与0μmol/L AUDA组相比,差异具有统计学意义(P0.05),给予PPARy抑制剂GW9662干预后,细胞的粘附能力降低(P0.05)。1.3随着加入AUDA浓度的增加,OD值逐渐升高,提示AUDA以浓度梯度的方式促进HCAECs的增殖,与Oμmol/LAUDA组相比,差异具有统计学意义(P0.05)给予PPARy抑制剂GW9662干预后,细胞的增殖能力降低(P0.05)。1.4随着加入AUDA浓度的增加,测量的血管主干长度逐渐增长,提示AUDA以浓度梯度的方式促进HCAECs的血管生成能力,与Oμmol/L AUDA组相比,差异具有统计学意义(P0.05),给予PPARγ抑制剂GW9662干预后,细胞的血管生成能力有所降低(P0.05)。1.5加入100μmol/LAUDA显著增强了HCAECs中PPARy的表达水平(P0.01),PPARγ敲降组细胞增殖能力显著下降(P0.05),而PPARγ过表达作用则相反(P0.01),100μmol/LAUDA增强了细胞增殖能力(P0.01);在 100μmol/LAUDA干预的细胞中敲降PPARγ后,细胞增殖能力降低(P0.05)。上述结果提示,AUDA可能通过上调PPARγ促进人冠状动脉内皮细胞的增殖。1.6 100μmol/L AUDA干预人冠状动脉内皮细胞或过表达PPARγ后,STAT1 mRNA水平显著下降(P0.05);而PPARy敲降组STAT1 mRNA水平显著上升(P0.01)。在100μmol/LAUDA干预的细胞中敲降PPARγ后,STAT1表达上升到对照组水平(P0.05)。上述结果表明,AUDA可能通过上调PPARy抑制JAK/STAT1信号通路,进而发挥抗炎作用。2.采用干酪乳杆菌细胞壁成分(LCWE)腹腔注射建立C57BL/6小鼠川崎病模型,探讨AUDA对小鼠冠状动脉炎症的影响,并进一步从蛋白和基因水平检测心脏组织中TNF-α、IL-1β、MMP-9炎症因子的表达变化。2.1心脏组织病理切片结果显示:PBS组小鼠,心脏组织没有明显的炎症细胞浸润,而LCWE组小鼠,第14天炎症细胞浸润明显。脾脏组织病理切片显示:PBS组小鼠脾脏结构清楚,脾小体结构完整,而LCWE组小鼠脾小体增生、融合,以14天最明显。2.2实时荧光定量RT-PCR和ELISA结果显示,注射LCWE后第3天14,15-EET的表达水平显著升高,第14天表达水平下降,第28天基本降至正常对照水平(P0.05)。2.3以注射各组药物后第14天的小鼠为研究对象,PBS组小鼠,心脏组织没有发现有明显的炎症细胞浸润,而LCWE组小鼠,冠状动脉周围有明显炎症细胞浸润,LCWE+AUDA组,有少许炎症细胞浸润,而LCWE+AUDA+GW9662组,与LCWE+AUDA组相比,炎症细胞浸润增多。2.4以注射各组药物后第14天的小鼠为研究对象,LCWE组小鼠心脏组织中TNF-α、IL-1β、MMP-9的蛋白水平均高于PBS组,LCWE+AUDA组TNF-α、IL-1 β、MMP-9的蛋白水平均低于LCWE组;而LCWE+AUDA+GW9662组,与LCWE+AUDA组相比,TNF-α、IL-1β、MMP-9的蛋白水平增高(P0.05)。2.5以注射各组药物后第14天的小鼠为研究对象,与PBS组相比,LCWE组小鼠心脏组织中TNF-α、IL-1β、MMP-9的基因水平显著升高;LCWE+AUDA组中TNF-α、IL-1β、MMP-9的基因水平均低于LCWE组;而与LCWE+AUDA组相比,LCWE+AUDA+GW9662组中TNF-α、IL-1β、MMP-9的基因水平增高(P0.05)。3.EETs在川崎病患儿外周血中的表达变化及临床意义:3.1与健康对照组相比,14,15-EET在川崎病患儿外周血中表达增强(P0.01)。3.2与无冠脉损伤的川崎病患儿相比,14,15-EET在发生冠脉损伤的川崎病患儿外周血中高表达(P0.05)。3.3与健康对照组相比,TNF-α、IL-1β和MMP-9在川崎病患儿外周血中的表达水平显著上调;与无冠脉损伤的川崎病患儿相比,在发生冠脉损伤的川崎病患儿外周血中异常高表达(P0.05)。结论:1.AUDA能够促进人冠状动脉内皮细胞的功能,促进血管修复;2.AUDA能够减轻川崎病小鼠心脏组织的炎症反应;3.AUDA发挥上述作用可能是通过PPARy/STAT1信号通路实现的;4.川崎病患儿外周血EETs表达升高;合并冠脉病变者表达水平更高,提示EETs对川崎病患儿可能有保护作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R725.4
【图文】：

逦０逦１逦１０逦５０逦１００邋１００＋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＵＤＡ邋（ｐｍｏｌ／Ｌ）逡逑图１－２邋ＡＵＤＡ对人冠状动脉内皮细胞粘附能力的影响逡逑Ａ－Ｅ：经过不同浓度（０、１、１０、５０、ｌＯＯｐｍｏｌ／邋１）邋ＡＵＤＡ处理的人冠状动脉内逡逑皮细胞粘附情况；Ｆ：经ｌＯＯ＾ｍｏｌ／１邋ＡＵＤＡ＋５ｎｍｏｌ／１邋ＧＷ９６６２处理的人冠状动脉逡逑内皮细胞粘附情况（ｌ00ｘ）。＊邋Ｐ＜０．０５（与对照组邋0ｎｍｏｌ／ｌ），邋＃Ｐ＜０．０５（与邋ｌＯＯ＾ｍｏｌ／逡逑６２逡逑

０逦１逦１０逦５０逦１００邋１００＋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＵＤＡ邋（邋ｐｍｏｌ／Ｌ）逡逑图１－４邋ＡＵＤＡ对人冠状动脉内皮细胞血管生成能力的影响逡逑Ａ－Ｅ：经过不同浓度（０、１、１０、５０、ｌＯＯｐｍｏｌ／邋１）邋ＡＵＤＡ处理的人冠状动脉内逡逑皮细胞血管生成情况；Ｆ：经ＨＫＨｍｉｏｌ／ｌＡＵＤＡ＋５＾ｉｍｏｌ／ｌＧＷ９６６２处理的人冠状逡逑动脉内皮细胞血管生成情况（ｌ00ｘ）。＊Ｐ＜０．０５（与对照组０ｐｍｏｌ／ｌ），邋＃Ｐ＜０．０５逡逑（与邋ｌＯＯｊｘｍｏｌ／１邋组）。逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｔｈｅ邋ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ＡＵＤＡ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ邋ａｂｉｌｉｔｙ邋ｏｆ邋ｈｕｍａｎ邋ｃｏｒｏｎａｒｙ邋ａｒｔｅｒｉａｌ逡逑ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌｓ逡逑６４逡逑

３逦１４逦２８逡逑Ｄａｙ逡逑图２－１小鼠体重变化情况（＊Ｐ＜０．０５，与对照组相比）逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｔｈｅ邋ｂｏｄｙ邋ｗｅｉｇｈｔ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｍｉｃｅ，邋＊Ｐ＜０．０５邋ｖｓ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ．逡逑３ｄ逦１４ｄ逦２８ｄ逡逑图２－２小鼠对照组及实验组各时间点（３、１４、２８天）脾脏组织ＨＥ染色情况（１００ｘ）逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｔｈｅ邋ｓｐｌｅｎｉｃ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｍｉｃｅ邋ｂｙ邋ｕｓｉｎｇ邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ（１０0ｘ）逡逑６６逡逑

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 彭江峰;黄敏;;以神经系统症状首发的不完全川崎病1例报告[J];柳州医学;2007年01期

2 顾爱兰;;对川崎病患儿运用追踪延伸护理的效果观察[J];中外女性健康研究;2018年23期

3 张红艳;薛莹莹;;川崎病的观察和护理[J];首都食品与医药;2019年02期

4 张永远;温晓红;;婴儿川崎病的早期临床和血液学特点[J];临床输血与检验;2019年01期

5 肖

本文编号：2774532