新生重度HIBD大鼠心肌CT-1mRNA表达及其与心肌细胞凋亡的相关性

发布时间：2020-08-07 23:34

【摘要】： 目的：本实验通过制备新生大鼠重度缺氧缺血性脑损伤(HIBD)合并心肌损伤的模型,留取心肌组织,检测其中CT-1mRNA的表达和相关凋亡基因的水平变化,及其与心肌细胞凋亡率的关系,探讨重度HIBD合并心肌损伤的发病机制,为临床治疗提供新的思路。方法：1.制备重度HIBD合并心肌损伤模型：新生7日龄wistar大鼠64只,随机分为对照组8只,实验组56只。实验组双侧结扎并剪断左颈总动脉后,低氧处理2.5小时,观察缺氧时的行为变化。依不同时间点处死,观察结扎左侧脑皮层大体病理变化并取脑切片行TTC染色观察病理变化。观察心脏大体病理变化并取心脏切片行HE染色观察病理变化。 2.取大鼠心肌组织,应用western blot法检测心肌组织中CT-1mRNA及表达水平在缺氧后不同时间点的变化。 3.取大鼠心肌组织,应用PCR技术检测心肌细胞中凋亡基因Bcl-2和bax、fas、Caspasse-3水平在缺氧后不同时间点的变化。 4.取大鼠心肌组织,应用TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数在缺氧后不同时间点的变化及其与CT-1、凋亡基因的相关性。结果：1.HIBD组与对照组的比较HIBD组大鼠置于缺氧环境后先是躁动不安,然后不爱活动、倦怠,并出现不同程度的缺氧症状,如皮肤发绀、呼吸急促,还出现抽搐、大小便失禁,走路不稳,向左侧旋转。HIBD组大鼠左侧半球脑组织受损较严重,苍白、水肿明显,并可看到结扎侧半球局部出现液化坏死灶,TTC染色可见右侧半脑组织呈深红色,左侧半脑组织呈苍白色。HIBD组心肌收缩无力,心率快而不易数清,节律欠规整,心肌呈暗红色。HE染色见心肌细胞肿胀,间质水肿,肌间隙增宽,心肌细胞排列紊乱,可见肌丝断裂,出现肌溶解。 2. HIBD组与对照组相比,心肌细胞中CT-1mRNA水平及表达在缺血缺氧后2小时开始增加(P0.05),至48小时达到高峰,显著高于对照组(P0.001),CT-1mRNA水平在72小时、5天开始下降,与对照组相比其差异无统计学意义(P0.05),7天后低于对照组水平(P0.01)。其表达在72小时开始下降,但仍然显著高于对照组(P0.001),5天、7天继续降低,与对照组相比其差异已无统计学意义(P0.05)。二者成正相关(r=0.836,P0.001)。 3. HIBD组与对照组相比,促凋亡基因bax、fas、Caspase-3在缺血缺氧后2小时开始增加,bax、Caspase-3在48小时达到高峰,fas在72小时达到高峰,均显著高于对照组(P0.001), bax、Caspase-3在72小时开始下降,但仍然显著高于对照组(P0.001),7天时与对照组相比其差异已无统计学意义(P0.05)。fas在5天、7天开始下降,但仍然显著高于对照组(P0.001)。抑凋亡基因Bcl-2在心肌细胞中的水平在缺血缺氧后2小时开始显著降低(P0.001),至48小时降至最低,均显著低于对照组(P0.001),72小时开始升高(P0.001),5天、7天继续升高,但仍低于对照组(P0.005)。Bcl-2/bax二者比值也有同样的变化趋势,只是7天与对照组相比其差异无统计学意义(P0.05)。相关性分析结果显示CT-1mRNA及表达与bax、fas、Caspase-3水平呈正相关(P0.05)；与bcl-2水平、bcl-2/bax比值呈负相关(P0.001)。 4. HIBD组与对照组相比心肌细胞凋亡指数在缺血缺氧后2小时开始增加(P0.01),72小时达到高峰,均显著高于对照组(P0.001),5天、7天开始下降,仍显著高于对照组(P0.005)。相关分析结果心肌细胞AI与CT-1mRNA水平、CT-1mRNA表达、bax、fas、Caspase-3水平呈正相关(P0.01)；与bcl-2水平、bcl-2/bax比值呈负相关(P0.001) 结论1.通过观察大鼠一般情况、行为能力、脑组织大体形态、TTC染色,证实成功制备了重度HIBD新生大鼠动物模型。通过观察新生大鼠缺氧后表现、心脏大体形态、心肌细胞HE染色,证实该模型符合缺氧缺血性心肌损伤模型。 2.重度HIBD大鼠心肌细胞CT-1mRNA及其表达在缺氧后迅速升高,说明CT-1参与了HIBD合并的心肌损伤的发病过程。提示CT-1可用于心肌细胞损害的诊断。 3.重度HIBD大鼠心肌细胞促凋亡基因bax、fas、Caspase-3在缺氧后迅速升高,抑凋亡基因Bcl-2则呈下降趋势,凋亡指数升高,说明重度HIBD大鼠心肌细胞存在凋亡,重度HIBD大鼠合并有心肌损伤。 4. CT-1mRNA及其表达与心肌细胞凋亡基因、凋亡指数均存在良好的相关性,说明其可以通过参与心肌细胞凋亡的过程而在重度HIBD合并心肌损伤的发病过程中发挥重要的病理生理作用,为临床治疗提供新的思路。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R722.12
【图文】：

结果H旧D合并心肌损伤动物模型实验前大鼠较安静。呼吸频率波动在104一124次/min，平均112次/m组大鼠置于缺氧环境5分钟后开始躁动不安，呼吸频率加快，10分不爱活动，开始倦怠，均趴伏于容器的一角，出现了不同程度的缺氧如皮肤发组、呼吸急促、抽搐、大小便失禁等，并出现走路不稳，向肢体抖动(见图l)。IBD组大鼠左侧半球脑组织受损较严重，在24h时苍白、水肿明显，于对侧，72h可看到结扎侧半球局部出现液化坏死灶。TTC组化染色伤常用的神经病理学方法。在正常脑组织，线粒体氧化酶氧化TTC，使脑实质红染。缺血延长使线粒体酶功能障碍，不能氧化TTC，白色。TTC染色可见右侧半脑组织呈深红色，左侧半脑组织呈苍白大鼠大脑半球左右对称，未见任何病理变化(见图2)。

TTC染色,脑组织,标本

使脑实质红染。缺血延长使线粒体酶功能障碍，不能氧化TTC，导致脑呈苍白色。TTC染色可见右侧半脑组织呈深红色，左侧半脑组织呈苍白色。对照组大鼠大脑半球左右对称，未见任何病理变化(见图2)。图1夹尾左旋图2脑组织标本TTC染色1.3.对照组大鼠心脏搏动有力，心肌呈鲜红色，节律规整。HIBD组心肌收缩无力，心率快而不易数清，节律欠规整，心肌呈暗红色。1.4对照组大鼠心肌细胞胞核呈蓝色，胞浆及其他组织粉红色，排列规则，轮廓清晰，核膜、核仁均可见，H工BD组心肌细胞肿胀，间质水肿，肌间隙增宽，心肌细胞排列紊乱，可见肌丝断裂，出现肌溶解，肌细胞崩解，肌肉结构丧失(见图3及图4)。

心肌组织,琼脂糖凝胶,凝胶电泳

5S图5心肌组织总RNA琼脂糖凝胶凝胶电泳结果如图5所示，所提取的总RNA在1.0%的琼脂糖凝胶凝胶中电泳，可以看到清晰的285和185两个条带，浓度较高，位置正确，其光密度的比值约为2:1左右，说明提取的总RNA完整性好，基本无降解。总RNA在紫外分光光度仪上检测，其OD260/28。均介于 1.8一2.0之间，表明总RNA纯度好

【参考文献】