【摘要】：研究目的： 采用TaqMan-MGB实时荧光RT-PCR (real-time reverse transcriptase PCR, real-time RT-PCR)检测临床样本中人偏肺病毒(human metapneumovirus, hMPV)N基因的方法,并进一步用传统RT-PCR扩增阳性样本cDNA以进行基因序列分析；用直接免疫荧光(direct immunofluorescence assay, DFA)的方法对引起儿童急性下呼吸道感染(acute low respiratory tract infection, ALRTI)的呼吸道合胞病毒(RSV),腺病毒(ADV),A、B型流感病毒(IFV),1、2及3型副流感病毒(PIV)等7种常见呼吸道病毒抗原进行检测；以了解上海地区ALRTI患儿中呼吸道病毒感染状况及hMPV在上海地区流行株的分子流行病学特点；通过对同期标本中支原体、沙眼衣原体荧光定量PCR检测结果及细菌学培养结果的调查,较清晰的揭示2006年10月至2008年2月期间本地区儿童ALRTI的病原谱构成比与变化特点。 对象及方法： 1.收集2006年10月到2008年2月确诊为ALRTI住我院48小时内共1347例的患儿深部鼻咽分泌物(nasopharyngeal secretion, NPS)1347份标本。 2.用TaqMan-MGB实时荧光RT-PCR方法检测随机挑选(每周二、四采集)的622份NPS标本中人偏肺病毒(hMPV) RNA,阳性标本进一步用传统PCR扩增产物并进行基因序列分析。荧光RT-PCR的上游引物为5'-CATCAGGTAATATCCCACAAAATCAG-3',下游引物为5’-GTGAATATTAAGGCACCTACACATAATAA-3',探针为FAM-5’-TCAGCACCAGACACAC-NFQMGB-3';测序传统PCR的上游引物为5’-AACCGTGTACTAAGTGATGCACTC-3',下游引物为5’-CATTGTTTGACCGGCCCCATAA-3'。 3.用直接免疫荧光法方法检测1347份NPS中的呼吸道合胞病毒(RSV),腺病毒(ADV),A、B型流感病毒(IFV),1、2及3型副流感病毒(PIV)抗原。 4.对各种病毒在小儿ALRTI中所占比例、性别、年龄、季节分布及临床特点进行临床流行病学分析,并对hMPV检测及测序结果进行分子流行病学分析。基因序列分析用BLAST和DNAMAN软件对hMPV核苷酸序列作比较,并绘制基因进化树。 5.调查同期标本中支原体、衣原体荧光PCR检测结果及细菌学培养结果。 结果： 1. TaqMan-MGB实时荧光RT-PCR检测hMPV基因共检测出24份阳性标本,检出率为3.86%,阳性样本cDNA用另一对引物进一步用传统RT-PCR扩增,16份标本阳性；随机选取5份传统RT-PCR产物进行测序,测得的核苷酸序列经过BLAST比较,与GeneBank中已知hMPV序列的同源性在84%～100%之间；用DNAMAN软件进行基因分析发现,5份样本序列在进化树中聚类为2簇；5份样本基因序列变异性可表现为核苷酸的点突变,也可是临近几个碱基同时突变,甚至有单个或临近几个碱基的核苷酸缺失及插入突变。 2.622例患儿中,3月龄以下儿童hMPV检出率0.94%(2/213),3月龄到6足月以下儿童检出率3.95%(3/76),6月龄到1足岁以下儿童检出率2.73%(3/110),1岁到2足岁以下儿童检出率9.52%(6/63),2岁到5足岁以下儿童检出率6.98%(9/129),5岁以上儿童检出率3.23%(1/31)。2岁以下儿童占58.33%(14/24),5岁以下儿童占95.83%(23/24)。hMPV致ALRTI绝大多数在11月份到次年1月份之间(21/24)。2006-2007年冬季hMPV检出率6.60%(14/212),2007-2008年冬季hMPV检出率1.11%(2/180)。男性323例患儿中检测出hMPV阳性10例(3.10%),女性237例患儿检出hMPV阳性14例(5.91%)，男女检出率无差异(X2=2.63,P0.05)。 3.1347份标本中7种常见病毒共检出率为33.56%(452/1347),hMPV检出率为3.86%(24/622),总的病毒检出率35.19%(474/1347)；细菌检出率为24.64%(329/1335),支原体和衣原体检出率分别为7.85%(103/1312)和2.97%(39/1312),1347份标本总的病原学检出率为55.23%(744/1347),其中混合感染率为15.59%(210/1347),2份标本hMPV与RSV同时阳性,9份标本存在3种病原体同时感染。有44.77%的临床标本病原未明。 4.RSV检出率为28.36%(382/1347),为最常见的感染原。2006-2007年冬季RSV检出率31.16%(124/398),2007-2008年冬季RSV检出率38.59%(120/311)；2007年春季、夏季、秋季RSV检出率分别为21.05%(36/171)、8.64%(7/81)和31.40%(92/293)。2岁以下儿童为RSV最易感人群。3月龄以下儿童检出率36.36%(184/506),3月龄到6足月以下儿童检出率31.58%(72/228),2岁以下儿童占91.88%(351/382),5岁以下儿童占98.69%(377/382)。RSV阳性患儿多有喘息表现。 5.PIV检出率为2.82%(38/1347),低于RSV和hMPV;ADV检出率为1.86%(25/1347)；IFV检出率为1.19%(16/1347)；少见混合性病毒感染。 6.支原体和衣原体检出率分别为7.85%(103/1312)和2.97%(39/1312)。支原体在5岁以上儿童中的检出率为34.5%,衣原体在3月龄以下儿童中的检出率为6.8%。 结论： 1. TaqMan-MGB实时荧光RT-PCR检测hMPV基因具有快速、操作简便、敏感度高的特点,可应用于临床检测。2006年10月至2008年2月本地区存在两种基因型hMPV流行。 2.2006年10月至2008年2月上海地区ALRTI儿童NPS中hMPV的检出率为3.86%,2006-2007年冬季较2007-2008年冬季检出率高。hMPV所致儿童ALRTI以5岁以下小年龄儿童多见。 3.病毒病原在本地区儿童ALRTI中占有重要地位；2岁以下儿童ALRTI以病毒性感染为主,2岁以上到5岁以细菌性感染为主,到5岁以上则以支原体感染占优势。3月龄以下衣原体有6.28%的检出率,值得关注。 4.2岁以下儿童为RSV最易感人群；在本地区,2007-2008年冬季较2006-2007年冬季RSV有较强的流行；RSV感染更易表现有喘息症状。 5.2006年10月至2008年2月本地区儿童ALRTI中,8种病毒检出率为35.19%,细菌检出率为24.64%,支原体和衣原体检出率分别为7.85%和2.97%,仍有44.77%的临床标本病原未明。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R725.6
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