MicroRNA145-Adducin3通路及GBP-1在胆道闭锁发病中增殖紊乱的作用及其机制研究

发布时间：2020-09-08 10:37

　　 目的通过对 MicroRNA 145、Adducin3 及 GBP-1 在胆道闭锁(biliary atresia,BA)患儿肝脏组织中的表达水平变化,探讨MicroRNA145-Adducin3通路及GBP-1在胆道闭锁发病中增殖紊乱的作用及其作用机制。方法选取深圳市儿童医院2013年1月至2016年1月收治的临床及病理诊断为胆道闭锁的患儿60例(研究组),对照组选取同期年龄在6个月之内的非胆汁淤积性肝病且肝功能正常的患儿54例。第一部分:通过裂解研究组及对照组的肝组织并提取其总RNA后,分别用mRNA RT-PCR及MicroRNA RT-PCR法反转录、qPCR荧光定量分析法,检测BA肝组织中的ADD3 mRNA及MicroRNA-145的表达水平。第二部分:构建高表达MicroRNA-145、低表达Microma-145慢病毒,并分别转染至HepG2细胞内,用RT-PCR反转录及qPCR荧光定量、western blot方法分别检测不同MicroRNA-145表达量的细胞内ADD3 mRNA表达水平和蛋白表达水平。第三部分:检测GBP-1在不同程度肝脏纤维化肝脏组织中的表达,并利用自动医学彩色图像分析系统对其进行定量。第四部分:拟构建GBP1基因慢病毒载体,转染肝脏细胞从而上调其在肝脏细胞中的表达,探讨该基因高表达后对其下游因子尤其是MMPs表达的影响及对肝脏细胞的影响。结果第一部分:ADD3mRNA在BA组肝组织中表达量为4.638±0.3327,在对照组中表达为1.167 ± 0.1053;MicroRNA-145在BA组肝组织中表达为0.1578±0.03217,在对照组中表达为0.4557±0.1244。BA组肝组织中ADD3较对照组的明显升高(p0.05),MicroRNA-145较对照组的明显降低(p0.05)。第二部分:空白对照组的HepG2细胞内存在ADD3 mRNA及蛋白质的基础表达量,转染高表达MicroRNA-145后的HepG2细胞,其ADD3mRNA水平及蛋白质水平均较对照组细胞的低,而转染低表达MicroRNA-145后的细胞,其ADD3mRNA水平及蛋白质水平均明显低于对照组细胞。第三部分:GBP1在对照组肝脏组织中呈阴性表达;在BA肝脏组织中呈现不同程度表达,随着肝脏纤维化程度的加重,GBP-1表达水平增高。第四部分:TUNEL法检测HepG2凋亡情况发现,空载体质粒和未转染对照HepG2细胞未检测到凋亡,而转染Pcmv6-gbp1的HepG2细胞出现较多凋亡细胞。ELISA定量检测发现,MMP-1和MMP-2在pCMV6-gbp1转染HepG2细胞上清中表达降低,与对照组和空载体质粒组统计学差异(P0.05)。结论1、ADD3的过度表达可能与BA的发病相关。2、MicroRNA-145可能通过靶向作用于ADD3 3'UTR序列来改变ADD3的表达,而诱发了 BA的发生。3、GBP1可能与BA肝脏组织肝纤维化密切相关。4、GBP1可能通过促进肝细胞凋亡和抑制MMP-1和MMP-2的表达而导致胶原酶降解减低,从而引起了 BA的发生。但由于本研究只是在细胞水平的研究,需要进一步在动物水平上进行验证。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R725.7
【部分图文】：

一章邋ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５－ＡＤＤ３通路参与胆道闭锁发Ａ组肝组织呈高表达逡逑儿肝脏组织以及５４例对照组患儿肝脏组织，通水平，提示ＢＡ组患儿中的ＡＤＤ３ｍＲＮＡ表达义（２４．５９±５．８２７ｖｓ．０．４２３８±０．１５３５，ｐ＜０．０５）。ＡＤＤ３邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋Ｌｅｖｅｌ逡逑＜．

ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５表达水平。与内参基因ＧＡＤＰＨ校正后，１４５表达水平明显低于对照组患儿，具有统计学意义（ｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５邋ｉｎ邋ｌｉｖｅｒ邋ｔｉｓｓｕｅ．邋Ａｆｔｅｒ邋ｎｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５邋ｗａｓ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ邋ｌｏｗｅｒ邋ｉｎ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ邋（／？＝０．０２９２）．逡逑－１４５靶基因预测逡逑ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５在胆道闭锁疾病中的可能靶基因来对ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５可能存在的靶点进行预测［１ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５靶点，见图丨－３。逡逑ｂ逡逑ｕｕａａｇＡＡＣＵＧＧＡＡａ邋ＡＤＤ３逦ｆ邋＞逡逑Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ逦冬逡逑ｃｃｃｕｕＵＵＧＡＣＣＵｇ邋ｈａｓ－ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５－５ｐ逡逑？ｆｃ：邋＇．１４．２邋ｋｃ？ｌ／？？ｏｌ

ＨｅｐＧ２细胞ＡＤＤ３呈阴性表达，而转染低表达ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５逡逑（ａｎｔｉ－ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５－Ｐｌ）和空载体质粒（ｐＬＶＸ－ｖｅｃｔｏｒ）的邋ＨｅｐＧ２邋细胞邋ＡＤＤ３逡逑呈阳性表达，提示ｐｒｅ－ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５－Ｐｌ成功转染（见图２－３）。逡逑３１逡逑

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本文编号：2814080