PTEN、Lgr5和β-catenin在NEC肠道损伤修复中的变化观察

发布时间：2020-09-16 17:44

　　目的：制备并评估新生儿坏死性小肠结肠炎(Necrotizing enterocolitis, NEC)新生大鼠肠道损伤后自我修复的模型。观察新生大鼠NEC模型中肠道损伤修复过程中第10染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)、肠道干细胞标记物富含亮氨酸的G蛋白偶联受体(eucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5, Lgr5)和肠道损伤修复过程中的重要因子β-连环蛋白(cadherin associated protein beta, P-catenin)的变化,探讨PTEN、Lgr5和β-catenin在肠道缺血损伤与自我修复中的可能作用,为进一步研究NEC发病机制、可能的治疗方向提供思路。第一部分制备与评估NEC肠道损伤后自我修复的新生鼠模型方法：30只新生大鼠随机分为对照组15只(A组)和实验组15只(B组)。实验组在生后第1d起给予缺氧和冷刺激,连续3d,再分别于停止缺氧和冷刺激后24h、72h和120h脱臼处死,分为B1、B2和B3组,每组5只。对照组未予缺氧和冷刺激,同时间段处死,分为A1、A2和A3组,每组5只。于实验前和实验第4d分别测量两组新生鼠体重,观察体重变化情况。记录实验组制模过程中新生鼠对刺激的反应,有无腹胀、胃潴留、活动度下降等情况。处死后取新生鼠肠道组织标本,H.E.染色,Nadler评分标准评估模型中新生鼠肠道粘膜损伤与修复情况。结果：1.实验组新生鼠给予缺氧和冷刺激后相继出现不同程度的活动下降,进奶量减少,轻到中度的腹泻,可见明显的腹胀和胃潴留,且在给予刺激的3d内渐有加重,而在停止刺激后72h和120h症状又逐渐消失。 2.实验组在缺氧和冷刺激后体重增加量明显低于对照组,P0.05,有统计学意义。 3.大体解剖时发现,对照组新生鼠肠壁色泽红润、弹性好；而实验组B1组部分肠段可见水肿、增厚及明显的出血点；而B2和B3组肠壁色泽又趋于基本正常。 4.H.E.染色可见对照组回盲部绒毛结构完整、粘膜完好、上皮完整、连续、腺体排列规则、组织结构清楚、分泌功能活跃、固有层血管无扩张,肌层无异常,无炎性细胞浸润及溃疡。实验组B1组肠粘膜和粘膜下层充血、水肿,固有层较多炎症细胞浸润,Nadler病理组织评分均在2-3级之间。B2和B3两组肠粘膜损伤较B1组减轻,少量粘膜脱落,少量炎症细胞浸润,Nadler病理组织评分均在1-2级之间。第二部分PTEN、Lgr5和β-catenin在NEC肠道损伤修复中的变化观察方法：制备和评估NEC肠道损伤与自我修复的新生鼠模型后,在实验组停止缺氧和冷刺激后24h、72h和120h,分别获取不同组新生鼠末端回肠组织,利用Realtime PCR方法,测定组织匀浆中PTEN、Lgr5和β-catenin mRNA的表达水平。观察肠道损伤后自我修复过程中PTEN、Lgr5和β-catenin的变化,分析三者之间的关系,探讨三者可能的作用。结果：1.实验组与对照组相比,在停止缺氧和冷刺激后24h时,PTEN、Lgr5和β-catenin mRNA表达水平明显升高,有显著性差异(P=0.013；P=0.047；P=0.020),具有统计学意义。 2.停止缺氧和冷刺激后72h和120h时,实验组与对照组相比,PTEN.Lgr5和P-catenin mRNA表达水平不具显著性差异(P=0.630,P=0.864；P=0.481,P=0.353；P=0.472,P=0.259),无统计学意义。 3.实验组PTEN、Lgr5、β-catenin三者在24h时的表达水平无明显差异(P=0.053；P=0.105；P=0.681),无统计学意义。 4.实验组PTEN、Lgr5和β-catenin mRNA表达水平在24h时与72h和120h相比显著升高(P=0.002,P=0.001；P=0.011,P=0.001；P=0.030,P=0.006),有统计学意义。 5.实验组PTEN、Lgr5和β-catenin mRNA表达水平在72h与120h相比差异不大(P=0.941；P=0.525；P=0.746),无统计学意义。结论：1、6%O2的N2,4℃冷刺激,成功制备新生大鼠NEC肠道损伤修复模型。 2、NEC模型后24h,肠道损伤期,PTEN、Lgr5和β-catenin mRNA表达水平明显增加,显著高于对照组。 3、NEC模型后72h与120h,肠道修复期,PTEN、Lgr5和β-catenin mRNA表达水平较24h明显下降,与对照组比较,无显著差异。 4、肠道损伤期,β-catenin表达水平增加,可能与促进干细胞增殖有关。 5、PTEN负性调节β-catenin活性,可能在平衡干细胞增殖速度和数量上起到一定作用。
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2011
【中图分类】：R722.1
【部分图文】：

实验动物

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蛋白结构

贫日大学硕十研究生学位论文PT巨N、Lg巧不lr日一Cat。ni，:在NEcj汤道损伤修艾‘}，的变化观察瘤细胞生长、侵袭、转移，促进肿瘤细胞凋亡。研究发现，PTEN具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶双重活性，能够参与多种信号通路的调控，能够调节细胞生长、增殖、分化和凋亡。PTEN基因产物在诱导细胞周期阻滞、细胞凋亡和血.管新生诸方面起着重要作用。其编码的蛋白因具有双重特异性磷酸酶活性，不仅加快磷酸酞肌醇3，4，5三磷酸(PhosPhatidylinositol3一kinases，PxP3)的03位脱磷酸，拮抗磷脂酞肌醇3激酶(Phosphatidylinositol3，4，5一triphosphate，pl3K)的磷酸化，减少PIP3的聚集;而且促使蛋白激酶B(Proteinkinase，Akt)磷酸酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸去磷酸，降低Akt的磷酸化水平。引起细胞周期阻滞和诱导凋亡〔’9〕，阻止肿瘤的恶性演变。PTEN不仅与肿瘤的发生有关，在PTEN缺失的小鼠中，胎鼠死亡率明显增高，因此PTEN在胚胎的发育中起重要作用〔川。同时也发现下调PTEN能有效缓解由缺血再灌注所致的神经元损伤「纵。

【参考文献】