转染维甲酸受体α在肾小管上皮细胞缺氧损伤后转分化中的作用

发布时间：2020-09-19 15:04

　　目的:探讨转染维甲酸受体α(retinoic acid receptorα,RARα)在肾小管上皮细胞(NRK-52E细胞)缺氧损伤后转分化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)中的作用。方法:构建过表达RARα慢病毒载体和阴性慢病毒载体,分别对体外培养的NRK-52E细胞进行转染。基因干扰72h后,以2.0 mg/L嘌呤霉素进行筛选,采用荧光倒置相差显微镜及流式细胞术检测NRK-52E细胞的转染效率。将NRK-52E细胞分为4组:正常对照组、缺氧模型组、转染组、阴性病毒对照组。再将缺氧模型组、转染组、阴性病毒对照组NRK-52E细胞进行缺氧处理48小时,正常对照组不做任何处理。采用光学倒置显微镜观察细胞形态变化,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chainreaction,RT-qPCR)和蛋白免疫印迹法(western blotting,WB)检测NRK-52E细胞的RARα、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及波形蛋白(vimentin)的mRNA和蛋白表达。结果:1.荧光倒置相差显微镜观察转染组、阴性病毒对照组的NRK-52E细胞均可见均匀绿色荧光并且细胞状态良好,流式细胞术检测该两组的转染效率均97%。转染组细胞RARα的mRNA及蛋白表达较正常对照组和阴性病毒对照组均显著升高(均P0.05)。2.缺氧处理48小时后,光学倒置显微镜观察到缺氧模型组与缺氧干预后的阴性病毒对照组NRK-52E细胞均出现萎缩,呈长梭型,类似肌成纤维细胞形态改变;而缺氧干预后的转染组NRK-52E细胞萎缩不明显,细胞呈多方形,基本保留上皮细胞形态。3.与正常对照组相比,缺氧模型组NRK-52E细胞RARα、E-cadherin的mRNA和蛋白表达均显著降低(均P0.05),而α-SMA、vimentin的mRNA和蛋白表达均显著升高(均P0.05)。4.缺氧干预后的转染组NRK-52E细胞RARα、E-cadherin的mRNA和蛋白表达较缺氧模型组和缺氧干预后的阴性病毒对照组均显著升高(均P0.05),而α-SMA、vimentin的mRNA和蛋白表达较缺氧模型组和缺氧干预后的阴性病毒对照组均显著降低(均P0.05)。与缺氧模型组相比,缺氧干预后的阴性病毒对照组的NRK-52E细胞RARα、E-cadherin、α-SMA及vimentin的mRNA和蛋白表达均无显著差异(均P0.05)。结论:RARα表达降低可能参与肾小管上皮细胞缺氧损伤后EMT,转染RARα可减轻肾小管上皮细胞缺氧损伤后EMT的发生。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R726.9
【部分图文】：

荧光,相差显微镜,细胞转染,明场

用过表达RARα慢病毒载体和阴性慢病毒载体以MOI值为10，分别感染NRK-52E细胞，并用2.0mg/L的嘌呤霉素筛选后，两组细胞在荧光倒置相差显微镜下均可见均匀绿色荧光并且细胞状态良好，见图1-1。图1-1 荧光倒置相差显微镜下NRK-52E细胞转染后荧光表达情况（×200）Figure 1-1 The transfected NRK-52E cells were observed under fluorescent inverted contrast phasemicroscope(×200)A,B：分别在明场下，荧光下的转染组；C,D：分别在明场下，荧光下的阴性病毒对照组A,B：transfection group cells were observed under light and fluorescent microscope; C,D: negative controlgroup cells were observed under light and fluorescent microscope

细胞转染,流式细胞术,效率,病毒

1.2 流式细胞术检测NRK-52E细胞的转染效率以正常对照组的NRK-52E细胞为空白对照组，转染组及阴性病毒对照组的细胞转染效率均>97%，见图1-2。图1-2 流式细胞术评估NRK-52E细胞转染效率Figure 1-2 Flow cytometry was used to evaluate the transfection efficiency of NRK-52E cellsA：转染组，B：阴性病毒对照组，C：正常对照组A: transfection group, B: negative control group, C: normal group1.3 慢病毒载体转染NRK-52E细胞后RARα的表达情况转染组细胞RARα的mRNA表达量分别是正常对照组和阴性病毒对照组的6.42倍、9.58倍（均P <0.05），而蛋白表达量分别是正常对照组和阴性病毒对照组的1.81倍、1.98倍（均P <0.05）。与正常对照组相比，阴性病毒对照组细胞RARα的mRNA及其蛋白表达量均无显著差异（均P >0.05）。见表1-1，图1-3、1-4、1-5。

细胞转染,维甲酸受体,维甲酸受体α,蛋白表达

图 1-3 NRK-52E 细胞转染后维甲酸受体 α 的 mRNA 表达mRNA expressions of retinoic acid receptor α in the transfect RARα+: transfection group; Neg.control: negative control gral group, P<0.05; #：compared with negative control group, 图 1-4 NRK-52E 细胞转染后维甲酸受体 α 的蛋白表达rotein expressions of retinoic acid receptor α in the transfect

【参考文献】