孕期边缘型维生素A缺乏对仔鼠肺发育的影响及机制研究

发布时间：2020-09-19 17:36

　　第一部分孕期边缘型维生素A缺乏对仔鼠肺结构和上皮发育的影响目的:了解胚胎期开始的边缘型维生素A缺乏(MVAD)对仔鼠生后不同时间点肺发育、肺泡结构和肺泡上皮的影响,以及在生后早期给予维生素A干预(VAI)对肺损伤的恢复程度。方法:清洁级健康雌性Wistar大鼠18只随机分为3组,饲以相应饲料,3周后与健康雄性Wistar大鼠交配,1:2雌雄合笼:(1)正常对照组(Control)(6只),给予VA充足饲料(含VA 6500 IU/kg),随机抽取39只仔鼠用于本实验,仔鼠饲料与母鼠相同;(2)MVAD组母鼠(6只),给予MVAD饲料(含VA 400 IU/kg) ,随机抽取39只仔鼠用于本实验,仔鼠饲料与母鼠相同;(3)生后干预组(VAI)(6只),给予MVAD饲料至分娩,然后改饲VA充足饲料,随机抽取39只初生仔鼠用于本实验,仔鼠于生后1天开始给予5倍RNI VA灌胃,每天一次连续7天,断乳后换为正常饲料。各组仔鼠于出生时、生后2周、8周龄处死。记录仔鼠体重和肺重,用高效液相色谱法(HPLC)检测血清和肺组织VA浓度,形态定量学方法分析肺泡隔厚度,肺泡数量和肺泡表面积的改变,同时用半定量RT-PCR方法检测肺泡上皮特有的表面活性物质相关蛋白SP-B,SP-CmRNA水平的变化。结果:①血清VA浓度:MVAD母鼠交配时血清VA浓度明显低于对照组,孕鼠和仔鼠未出现明显VA缺乏的临床表现。仔鼠生后各时间点血清VA浓度均低于Control组(P0.05),而肺组织VA浓度出生时和正常组无明显区别,但2周和8周时低于正常组(P0.05)。VAI组生后2w血清VA浓度即恢复至正常,而肺组织VA浓度一直维持在稳定水平,和正常组无明显区别。②体重和肺重:MVAD组出生时、生后2周体重均明显低于正常对照组(P0.05),8周时3组体重差异无统计学意义,但正常组和VAI组均略高于MVAD组。MVAD组仔鼠各时间点肺重均低于正常对照组(P0.05),VAI组8周时肺重恢复至正常水平。肺重/体重分数显示各时间点三组间无差异,2周和8周时MVAD组和VAI组略高于正常对照组。③肺组织形态学定量分析:MVAD组仔鼠在各时间点肺泡隔均显著厚于正常对照组(P0.05),2周和8周时肺泡表面积和肺泡数量均少于正常对照组(P0.05)。VAI组8周时除肺泡表面积仍少于正常对照组其余无明显区别。④肺表面活性物质相关蛋白:正常对照组肺组织表面活性物质相关蛋白SP-B,SP-CmRNA水平生后1天、2周和8周无明显区别,但MVAD和VAI组各时间点均高于Control组(P0.05)。结论:①从胚胎期开始的MVAD会影响仔鼠肺发育过程,表现为肺重的减轻,肺泡隔增厚,肺泡数量和肺泡表面积的减少,可持续至成年期。②生后早期进行VA干预可以恢复大部分肺发育和结构的改变,但至成年期时肺泡表面积仍不能完全恢复至正常。③MVAD会导致肺泡上皮特有的表面活性物质相关蛋白SP-B,SP-C mRNA水平上调,而VAI组这种改变也不能恢复至正常水平。第二部分孕期边缘型维生素A缺乏对仔鼠肺基质的影响目的:探讨胚胎期开始的边缘型维生素A缺乏(MVAD)对仔鼠生后不同时间点肺间质细胞外基质弹性纤维、胶原的结构和量的影响,以及在生后早期给予维生素A干预(VAI)的恢复程度。方法:清洁级健康雌性Wistar大鼠18只随机分为3组,饲以相应饲料,同第一部分。各组仔鼠于出生时、生后2周、8周龄处死。用醛品红染色法检测肺组织弹力纤维的分布,结构和量的改变,用Masson三色染色法观察肺组织胶原纤维的分布,结构和量的改变,用碱水解法测定肺组织羟脯氨酸含量。结果:①弹性纤维被染成紫红色,沉积在肺泡间隔,细支气管。生后1天MVAD组未发现弹性纤维的减少,但在2周和8周时明显低于正常对照组(P0.05),弹性纤维结构粗糙不光滑。生后早期VA干预可以使弹力纤维恢复至正常组水平,结构也变得规则有序。②胶原被染成蓝灰色,沉积在肺泡间隔,细支气管及血管壁,排列整齐。MVAD组肺泡间隔、细支气管、小血管胶原纤维明显增多,互相交织呈网状,着色较深,外表粗糙。MVAD组胶原蛋白的沉积在生后1天低于正常对照组,但在生后2周(P0.05)及8周(P0.05)时高于正常对照组,但是呈现的是无规律的形态。生后早期VA干预在2周及8周时能降低胶原的沉积,且形态规则。③随着年龄增长各组仔鼠肺组织羟脯氨酸含量逐渐增加,MVAD组出生时羟脯氨酸略低于Control组,但差异无统计学意义,2周和8周时明显增加(P0.05)。VAI组出生时略低于Control组,生后2周、8周和Control组相比无明显差异。结论:①从胚胎期开始的MVAD会影响仔鼠肺基质弹力纤维的结构和量,主要表现为生后弹力纤维的减少和结构的紊乱。②从胚胎期开始的MVAD会影响仔鼠肺基质胶原的分布和沉积,表现为生后2周和8周胶原纤维的过度沉积和结构紊乱,而羟脯氨酸也显示胶原蛋白的增多。③而生后早期给予VA干预可以使弹力纤维和胶原结构和量恢复至正常水平。第三部分孕期边缘型维生素A缺乏影响仔鼠肺发育机制的研究目的:进一步探讨胚胎期开始的MVAD对仔鼠肺发育的影响是否通过调节其体内活性代谢物质RA的核受体RARs发挥作用。方法:清洁级健康雌性Wistar大鼠18只随机分为3组,饲以相应饲料,同第一部分。各组仔鼠于出生时、生后2周、8周龄处死。用半定量RT-PCR方法检测肺组织RARα、β、γ的mRNA水平,用免疫荧光激光共聚焦方法观察RARs在肺组织中的空间分布和表达量的改变,进一步用western-blotting方法了解RARs蛋白水平的变化及亚细胞定位。结果:①生后正常肺组织中RARa mRNA表达最强,而RARγ表达最弱。RARa和RARβ均在出生时表达最强,随着年龄的增长至成年期表达减弱,RARγ无明显变化。MVAD对于RARa和RARβ的mRNA水平有明显影响表现为转录水平的增强(P0.05)。②免疫荧光激光共聚焦显示荧光强度变化与mRNA表达基本相符。生后RARs的空间定位主要为肺泡间隔的一些散在的细胞中,在支气管和血管仅有少量的表达。而MVAD对于空间定位无明显影响。③western-blotting的结果显示MVAD组RARa和RARβ蛋白水平在2周和8周是明显增加。提示VA对于RARs的转录水平和蛋白水平均有明显的影响。而RARs蛋白的表达存在胞核向胞浆的转移过程,表现为在8周肺泡发育结束时,RARa和RARβ也从胞核中转移至胞浆。而RARs蛋白的亚细胞定位也受到VA营养状态的影响,MVAD时胞核表达明显增强,至8周时胞核内仍有表达。但生后早期的干预RARs mRNA、蛋白水平和亚细胞定位不能恢复至正常。结论:①肺表达RARs受体的种类和量具有一定的年龄阶段性,而这种特异性伴随肺泡发育的全过程。不同年龄阶段RARs的亚细胞定位存在从胞核至胞浆的转移过程,而这一过程与生后肺泡发育的过程有明显的相关性,这种转移可能反应了蛋白转化和成熟的改变,是RA功能多样性的分子基础。②RARs的量和定位明显受到机体VA营养状态的影响。MVAD可以导致RARs表达的增加,且胞核表达增加可能为机体的代偿性的反应,而生后早期VA干预也不能使RARs的表达和定位完全恢复至正常水平,进一步提示孕期VA营养对于肺有序正常发育有重要的作用。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2008
【中图分类】：R725.6
【部分图文】：

示意图,人类,过程,示意图

而肺发育至完全成熟尚需延迟到出生以后的幼儿期，因此肺发育成熟的过程相对漫长(见图1)。大鼠肺泡的发育在生后持续超过 21 天，生后的头两周是肺泡形成和分隔的重要时期[10]。肺泡的形成还需要间质和上皮细胞的相互作用，包括初级和次级肺泡隔向肺泡腔的突出以及形成新的肺泡隔所需要的细胞外结缔组织框架结构的形成[11]。肺间质可以产生生长因子(EGF、TGF-α/β 和 FGF-7)以及基质分子(胶原、弹性蛋白以及蛋白多糖)，它们都能刺激上皮细胞分化和增殖，诱导肺脏的分支形成。同样，上皮细胞也产生生长因子(PDGF、IGF、TGF-β 以及 MMPs)，并通过细胞—细胞间的接触，诱导成纤维细胞增殖，出现基质的沉积。图 1 人类肺发育过程的示意图Fig 1 The process of lung development in human肺的分化、发育、生长和健康受到VA的影响[12]。已经有研究报道母鼠孕期VA缺乏(血浆VA浓度为0.26±0.03μmol/ L)会影响胎儿发育，导致肺重量减轻，支气管发育异常，弹性蛋白的沉积也减少[13]。Christos等[14]从合笼开始给予雌性大鼠VAD的饲料，至孕20天时处死母鼠，此时血浆VA浓度为0.27~0.31μmol/L

肺组织,HE染色,肺泡,肺泡隔

I*图1-6 肺组织HE染色(×100)。A,B,C: Control组生后1天，2周和8周. 观察到肺组织生后肺泡化过程，至8周时发育成为肺泡数量多、更薄的肺泡隔和规则的肺泡结构的形态。D,E,F: MVAD组生后1天，2周和8周。肺泡隔明显增厚，肺泡数量减少且形态不规则。G,H,I: VAI组l生后1天，2周和8周。8周时肺结构恢复至较薄的肺泡隔和规则的肺泡结构，但肺泡数量有减少。Figure 1-6 Slides of lung structure-HE (×100). A, B

仔鼠,时间点,肺组织

图 1-9 仔鼠肺组织 SP-B,SP-CmRNA 表达，MVAD 组和 VAI 组在生后各时间点均升高Fig 1-9 The SP-B, SP-CmRNA in lung of pups, increased in MVAD and VAI from postnatalday 1 to 8 weeks.

【参考文献】