胚胎后肾间充质细胞肾包膜下移植对急性肾小管坏死的保护作用

发布时间：2020-09-22 19:44

　　 研究背景急性肾衰竭(Actue Renal Failure，ARF)是一种病因复杂的临床综合征，病死率高达50％～80％。ARF最常见的病因为急性肾小管坏死(Acute Tubular Necrosis，ATN)，约占ARF的75％～80％。近20年来，尽管在支持治疗、肾脏替代治疗等方面取得了巨大的进展，但目前ATN仍缺乏特异性的治疗方法。近年来，细胞移植替代器官移植是目前移植及再生医学中非常热门的研究，如将骨骼肌细胞直接注入心肌梗死后的组织，神经元细胞注入帕金森患者的大脑，临床上均可见患者的部分功能得到恢复。尤其在神经领域，目前已证实这种移植治疗能够重建或修复受损的神经通路。肾小管是肾脏最容易遭受缺血、中毒、炎症等损伤的部位，肾小管上皮细胞在急性损伤后本身有一定的修复和再生能力，有研究认为小管上皮细胞增生时去分化成表型为胚胎／间充质性质的细胞是修复过程中关键的一步，增生的小管细胞迁移至损伤部位，取代坏死细胞，从而起到修复坏死小管，改善肾功能的作用。然而这种再生能力很大程度上取决于肾脏是否有足够多的新生细胞来取代损伤和死亡细胞，这正是目前阻碍愈合的最关键因素。因此，我们设想坏死的。肾小管通过外源性的补充足够多的具有分化能力的肾脏干细胞／祖细胞来替代、修复或改善受损的小管，即采用细胞再生技术治疗ATN，为临床提供强有力的实验依据。胚胎后肾间充质细胞(Metanephric Mesenchyme Cells，MMCs)是具有发育的多能性及自我更新能力的胚胎期肾脏干细胞，已证实单一的后肾间充质细胞就能产生除集合管以外的肾单位的所有上皮细胞，包括肾小管上皮细胞，即MMCs就是肾上皮前体细胞(MM-Epithelial Cell Precursor，MM-Ep)。将这种极具潜力的肾脏干细胞采用有效的方法导入体内发挥作用同样受到人们的关注。很多研究发现肾包膜下的微环境适宜胚胎后肾的发育、成熟。肾包膜下有丰富的血管床，注射的细胞能够很快的被周围的血管吸收入肾实质。基于以上各方面的研究，为探讨MMCs对急性肾小管损伤的再生修复作用，并为临床ATN治疗探索一条新的途径，本研究以大剂量庆大霉素诱导建立肾毒性急性肾小管坏死模型，同时肾包膜下移植一定数量的MMCs，通过体内示踪、检测肾功能、尿NAG酶等生化指标、肾脏形态学指标，以及对肾脏肾小管上皮细胞的增生、凋亡的研究，探讨MMCs对ATN大鼠肾脏的保护作用。 研究目的体外培养和扩增MMCs后，将MMCs移植到大鼠肾包膜下，探讨移植细胞对宿主急性肾小管损伤的再生修复作用及对肾小管上皮细胞凋亡的影响。 研究方法(1)胚胎后肾间充质细胞体外培养及扩增实验本实验所用的胚胎后肾间充质细胞RIMM-18细胞系，由美国马里兰州弗雷德里克国家健康研究所Levashova博士惠赠，已证实具有干细胞样特性。①RIMM-18细胞系复苏、培养及扩增复苏：37℃水浴箱快速复温，洗涤细胞——用吸管吸出细胞后，离心，加10倍以上的培养基混合后再离心，弃上清液，重复洗一次。培养：RIMM-18细胞培养所用的完全培养基为DMEM／F12+5％胎牛血清+碱性成纤维细胞生长因子(10ng／mL)+17β-雌二醇(100nmol／L)，37℃、5％CO_2、饱和湿度恒温箱中培养，2～3天换液1次。传代：D-Hank's液洗涤细胞2次，1ml 0.25％胰酶／0.02％EDTA(1∶1)混合消化液消化约3～5分钟，将细胞轻轻吹打成单细胞悬液，完全培养基终止消化，细胞计数板计数，以10~4个／mL传代。②体外示踪实验(DAPI标记MMCs)：传代细胞长满后，培养液中加入DAPI(终浓度50μg／mL)孵育40分钟后，D-Hank's液反复洗涤细胞7次，以去除未与细胞结合的DAPI。分别于标记后40分钟、5d、8d、11d、14d在荧光镜下观察细胞。③RIMM-18细胞系鉴定：倒置显微镜下及H．E、Giemsa染色观察细胞形态，免疫细胞化学染色法行生物学特性的鉴定。 (2)胚胎后肾间充质细胞右肾包膜下移植对急性肾小管坏死保护作用的实验研究167只8～10周龄雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠按随机数字法分为5组：①正常对照组(Control，Control组)：不做任何处理；②急性肾小管坏死组(Acute Tubular Necrosis，ATN组)：以庆大霉素200mg／(kg.d)连续4天皮下注射，诱导建立大鼠急性肾小管坏死模型；③ATN加假手术组(Acute Tubular Necrosis plus Sham Operation，ATN+Sham组)：庆大霉素200mg／(kg.d)连续4天皮下注射，注射第1天同时右肾包膜下多点注射0.2mL生理盐水；④ATN加培养基组(Acute Tubular Necrosis plus Media，ATN+Med组)：庆大霉素200mg／(kg.d)连续4天皮下注射，注射第1天同时右肾包膜下多点注射0.2mL无血清培养基；⑤ATN加细胞移植组(Acute Tubular Necrosis plus Celluar Transplantation，ATN+Cell组)：庆大霉素200mg／(kg.d)连续4天皮下注射，注射第1天同时右肾包膜下多点注射0.2mL细胞(细胞浓度约5×10~7个／mL，无血清培养基稀释)。每组均为4天成模，庆大霉素注射后第5、8、11、14天(即成模后第1、4、7、10天)每组分别取6只老鼠处死，为观察荧光分布，ATN+Cell组还在注射第2天处死6只大鼠，处死前均称重、留24小时尿液，采集血以及肾组织标本，检测不同时间点以下指标：①体内示踪实验；②检测血及尿肾功能生化指标；③肾组织形态学改变及病理评分；④免疫组化法检测肾小管上皮细胞增生标志物Ki-67，计算增殖指数。 (3)胚胎后肾间充质细胞对肾小管坏死后细胞凋亡的影响动物实验分组及处死大鼠的时间同第2部分，各实验组大鼠检测以下指标：①末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TDT-mediated dUTP-biotin Nick End-Labeling，TUNEL)检测肾皮质凋亡细胞；②RT-PCR方法检测大鼠肾皮质Bcl-2mRNA表达；③免疫组化方法检测肾皮质凋亡相关因子Bcl-2蛋白表达水平。 研究结果(1)胚胎后肾间充质细胞体外培养及扩增实验成功体外培养及扩增RIMM-18细胞系，荧光显微镜下可见细胞在波长为370nm的激发波下，胞核近似圆形，发出耀眼的绿色荧光。光学显微镜下可见H．E．及Giemsa染色的贴壁细胞胞体较大，梭形，有分散集落生长的特性。免疫细胞化学法证实扩增的细胞具有间充质特性，即波形蛋白表达阳性，角蛋白表达阴性。 (2)胚胎后肾间充质细胞右肾包膜下移植对急性肾小管坏死保护作用的实验研究肾包膜下移植胚胎后肾间充质细胞组大鼠：①大鼠死亡率明显降低；②肾功能指标改善；③右肾皮质病理改变减轻；④右肾皮质小管上皮细胞增殖明显。 (3)胚胎后肾间充质细胞对肾小管坏死后细胞凋亡的影响肾包膜下移植胚胎后肾间充质细胞组大鼠右肾：①肾小管上皮细胞凋亡减少；②凋亡抑制因子Bcl-2 mRNA上调；③凋亡抑制因子Bcl-2蛋白表达水平增强。 研究结论(1) RIMM-18细胞系体外培养及扩增后仍然保持间充质干细胞特性。 (2)急性肾小管坏死大鼠右肾包膜下移植胚胎后肾间充质细胞后，移植细胞能够向损伤的肾小管部位迁移，肾功能及肾脏病理改善，肾小管上皮细胞增殖明显，从而促进了肾小管结构和功能的修复，降低了ATN大鼠死亡率。 (3)胚胎后肾间充质细胞移植后，肾皮质Bcl-2mRNA和蛋白水平上调，这可能是其促进肾小管上皮细胞再生修复的机制之一。
【学位单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2007
【中图分类】：R726.9
【部分图文】：

标记率观察期图1一 2DA卫I标记RIMM一18细胞后不同时间标记率的变化40分钟标记率1加%，随着观察期的延长，DAPI标记率逐渐下降，短期标记率较高.Figuml一ZD八卫 1labelingrateof犯MM一 18cellsatdifferenttimepoints. Thelabelingratewas100%at40而 nutes.Withthet诵 eProlonged，the labelingratewasdescented.Itshowedhighlabelingrateinshorttime· 1.2)RIMM·18细胞鉴定 (1)RIMMes18细胞形态学鉴定复苏后可见悬浮时细胞呈大小比较均匀的圆形，折光性好，传代第2天细胞开始贴壁生长，倒置显微镜下观察(图1一3)贴壁细胞呈梭形或成纤维细胞形，成簇聚集，有分散集落生长的特点，H.E染色(图1一4)细胞呈现为大而扁平的单层细胞

足实验要求例数，根据预实验大鼠死亡率，本实验共用SD大鼠161只(计数死亡率不包括户TN+Cell组造模第2天处死大鼠6只)，符合实验要求120只，死亡41只，各组大鼠存亡情况如下(表2一，图2一2):

N、户a， N+Sham、八TN+Med组比较在第2、5、8天无显著性差异伊>0.05)，第n、14天有显著性差异俨<0.05);八TN、ATN+sham、户JN+Med组之间无显著性差异(P>0.05)(表2一3，图2一3)。表2一3五组大鼠不同时间点24h尿量的变化(m日d)(牙幻)肠bleZ一 Thecbangesof24hurinevolumeinfivegrouPsatd政 renttime卯ints(m叨X万幻)第2天第5天第8天第n天第14天 Control9.85玖 .129.8月 .1710.35士 1.8210.63士 2.149.48纽.06 AIN13.8玖.78曲16.58土4.25ab20.8巧.55ab25.95士6.02.c21.05幻.21“ AIN+Sham15.5叹 .30ab18.88幻 .84ab22.87灯 .22ab26.38士7.26‘21.35幻.41鹅户口 N+Med14.9幻.56曲17.35巧.42曲23.97绍.04比25.35土 4.26K22.67士4.8梦 AIN+Cell12.75月.51.15.97幻.76.19.96士6.63.17.01巧.73.15.53幻.01. F2.6684.2144.4989.91815.422 P0.0560.0100.(X)70.(XX)0.(XX) aP<0.05vs.C冶ntr’o1毕 >0.05vs.户 JN+CeUcP<0.05vs.ATN+CeU~今-Control曰刁卜口ATNATN+Sham-;(一ATN+Med曰弓怜.ATN+Celln八口甘二Ut八勺Ul﨑dUOq‘0自11‘1.

本文编号：2824839